重组羧肽酶B研究

论文摘要

本文主要研究了重组猪羧肽酶原B在大肠杆菌中的表达和重组猪羧肽酶B的纯化、酶学性质和稳定性,并对构建的重组菌株进行了发酵研究。此外,还研究了重组人羧肽酶原B在毕赤酵母GS115中的表达情况。对Genbank上的猪羧肽酶原B基因[NM-214169]进行密码子优化,基因长1206bp,共编码402个氨基酸。表达载体是pET-28a,宿主菌株是大肠杆菌BL21（DE3）。猪源羧肽酶原B以包涵体形式表达,经过变、复性和胰蛋白酶激活,得到有活性的羧肽酶B。DEAE-FF离子交换层析对猪源羧肽酶B的纯化效果十分理想。对重组猪羧肽酶B进行了性质研究,结果如下：Km值为0.27mmo1/L,Vmax为222.22μmol/min；最适催化pH是7.65,最适催化温度是25℃,在pH5.0-9.0和温度4-30℃的范围内稳定性良好；Cu2+能够较大程度地抑制其活性,而Co2+能使其活性大幅提高,将近提高1倍,所研究的其他几种金属离子对该酶活性的影响程度不大；EDTA也能抑制其活性,EDTA的浓度越大,对酶活的抑制作用越强。在摇瓶培养的基础上,对重组猪羧肽酶原B的表达菌株进行了5L发酵,发酵使用葡萄糖为碳源,胰蛋白胨、酵母提取物提供氮源、生长因子等,此外还有无机氮源、无机盐等。发酵过程中以氨水来调节pH,并流加葡萄糖和酵母提取物。经过发酵得到了312g菌体（湿重）,经破碎后,洗涤,获得36g重组猪羧肽酶原B的包涵体。构建了重组人羧肽酶原B的酵母表达菌株,宿主菌是毕赤酵母GS115,载体pPIC9k,先将目的基因转入大肠杆菌DH5a扩增,然后抽质粒线性化后电转化到GS115的感受态细胞。用0.5%的甲醇诱导重组蛋白的表达,pPIC9k是分泌型的表达载体,重组蛋白以可溶形式表达分泌到胞外的培养基中。分泌到培养基中的目的蛋白的浓度是0.13mg/ml,酶解后的活性是0.4U/ml。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 研究背景
• 1.1 羧肽酶B简介
• 1.1.1 羧肽酶原B的结构
• 1.1.2 羧肽酶B的活化
• 1.1.3 羧肽酶B的应用
• 1.1.4 羧肽酶B的研究进展
• 1.2 重组蛋白的原核表达
• 1.2.1 稀有密码子影响重组蛋白的合成
• 1.2.2 重组蛋白的分泌
• 1.2.3 重组蛋白的二硫键
• 1.3 蛋白的折叠、聚集与包涵体
• 1.3.1 蛋白的折叠
• 1.3.2 蛋白的聚集
• 1.3.3 包涵体
• 1.4 重组蛋白在酵母中的表达
• 1.4.1 重组蛋白的翻译后修饰
• 1.4.2 重组蛋白的稳定性
• 1.5 本课题研究目的和意义
• 第2章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料和设备
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 培养基的配置
• 2.1.3 常用试剂的配置
• 2.1.4 实验设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 毕赤酵母感受态细胞的制备
• 2.2.2 沉淀与浓缩分泌到胞外的蛋白
• 2.2.3 大肠杆菌质粒的转化
• 2.2.4 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.2.5 测定蛋白含量-Bradford法
• 2.2.6 羧肽酶B的测活方法
• 第3章 重组猪羧肽酶原B菌株的构建
• 3.1 引言
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 基因设计与合成
• 3.2.2 引物设计
• 3.2.3 PCR扩增目的基因
• 3.2.4 双酶切PCR产物和质粒pET-28a
• 3.2.5 构建表达载体
• 3.2.6 转化
• 3.2.7 表达鉴定
• 3.2.8 蛋白表达形式的鉴定
• 3.2.9 包涵体洗涤
• 3.2.10 包涵体的变、复性与酶解
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 PCR扩增结果
• 3.3.2 双酶切PCR产物和质粒pET-28a
• 3.3.3 表达鉴定
• 3.3.4 破碎菌体鉴定表达形式
• 3.3.5 包涵体的变、复性与酶解
• 3.4 本章小结
• 第4章 重组猪羧肽酶B的纯化与性质研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 重组猪羧肽酶B的纯化
• 4.2.2 跑蛋白电泳鉴定目的蛋白纯度
• 4.2.3 猪羧肽酶B性质研究
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 重组猪源羧肽酶B的纯化
• 4.3.2 纯化结果分析
• 4.3.3 重组猪羧肽酶B性质研究
• 4.4 本章小结
• 第5章 重组人羧肽酶原B毕赤酵母的构建与分泌表达
• 5.1 引言
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 重组质粒的构建与扩增
• 5.2.2 重组质粒转入酵母细胞
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 重组质粒的构建与扩增
• 5.3.2 重组质粒转入酵母细胞
• 5.4 本章小结
• 第6章 重组猪羧肽酶原B菌株的高密度发酵
• 6.1 引言
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 种子培养
• 6.2.2 发酵罐培养
• 6.2.3 补料
• 6.2.4 诱导
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 重组大肠杆菌的发酵进程
• 6.3.2 重组大肠杆菌的发酵进程曲线
• 6.3.3 重组蛋白表达情况
• 6.4 本章小结
• 第7章 结论与展望
• 参考文献
• 致谢