锌指结构转录因子Osterix在氟性骨损伤骨周化骨中的分子作用机制研究

论文摘要

氟性骨损伤（fluoride bone injury, FBI）骨周化骨是一种特殊的异位骨化形式（Heterotopic ossification,HO）,其主要临床表现为广泛性骨质增生/硬化、骨软化、骨质疏松、骨间膜、肌键和韧带钙化等。国内外关于FBI的研究大多集中在氟（fluoride, F）对骨细胞的损伤方面,对F导致骨关节硬化方面的研究较少,而后者才是导致慢性FBI患者致瘫致残的重要原因。成纤维细胞（fibroblast,FB）起源于胚胎间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）,具有多分化潜能,在在F的刺激作用或某些病理条件下,这些FB还可进一步向成骨细胞（osteoblast, OB）转化,进一步在非骨组织内发生钙化,引起HO。因此,本实验选择具有成骨潜能的FB作为研究对象,通过建立体外染F模型,并对不同染F剂量组和时间段的染氟成纤维细胞（fibroblast exposed to fluoride, FBEF）的活力和增殖活性进行了初步鉴定,并在此基础上,进一步研究了F对锌指结构转录因子Osterix（Osx）和骨钙素（Osteocalcin, Ocn）转录和表达的影响。初步分析了:1)引起FB向成骨表型转换的最佳染F时间剂量;2)Osx和Ocn在此转换过程中转录或表达的变化情况,分析引起二者变化的最佳染F时间和剂量,并进一步分析二者转录或表达之间的相关性;3)检测Osx和Cbfα1在职业性F暴露人群中的表达水平;4)探讨Osx和Cbfα1在FBI骨周化骨过程中的作用机制,进一步阐明F-FB-FBI骨周化骨三者之间的关系。本研究主要由以下三部分组成:第一部分不同染氟剂量组和染氟时间段染氟成纤维细胞的增殖活性目的:建立体外传代培养小鼠FB L929染F模型,探讨F对小鼠FB L929活力和增殖活性的影响,为第二部分的试验确定合适的染F剂量和染F时间。方法:传代培养的小鼠FB L929分别预设七个染F剂量组:0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10、20mg/L,9个染F时间段:1、2、4、8、12、24、48、72、96h,采用台盼蓝排斥试验法,观察不同染F剂量组和不同染F时间段FB的存活情况;用MTT法测定FBEF的增殖活性。结果:1)细胞活力:与对照组相比,0.1、1、10和20mg/L剂量组活细胞率明显下降（p<0.05）,仅20mg/L剂量组的活细胞率小于50%;2)细胞增殖活性:0.0001mg/L和0.001mg/L剂量组,几乎在各染F时间段FB的增殖活力均增加（p<0.05）,其中在12、24和48细胞活性增加比较明显（p<0.05）;0.01mg/L和0.1mg/L剂量组,只有12、24、48和72h细胞活性增加（p<0.05）,其余各组均随染F时间的延长和染F剂量的增加,细胞增殖活性呈现明显下降趋势。结论:1)F对FB的活力有抑制作用,染F剂量与FB活细胞率呈现明显的剂量-效应关系;2)F对FB的增殖活性的影响呈现一定的剂量-时间-效应关系,即短时间-低剂量的F明显增强FB的增殖活力,随着染F剂量的增加和染F时间的延长,FB的增殖活力明显减弱。确定后续实验的染F剂量为0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10mg/L,染F时间为2、4、8、12、24、48、72、96h。第二部分锌指结构转录因子Osterix和骨钙素在染氟成纤维细胞中的表达目的:检测Osx和Ocn基因在FBEF中的转录和蛋白表达,探讨Osx和Ocn在FBI骨周化骨中作用机制。方法:1)Osx和Ocn蛋白的检测:将传代培养小鼠FB L929分别暴露于以下6个不同的染F剂量组:0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10mg/L,分别按8个时间段进行染F:2、4、8、12、24、48、72、96h,分别采用Western blot和Elisa法,分别检测Osx和Ocn蛋白在每个染F时间段和染F剂量组的FBEF中的表达量;2)Osx和Ocn mRNA基因的检测:将传代培养小鼠FB L929分别暴露于以下6个不同的染F剂量组:0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10mg/LNaF,分别染F 24、48、72h后,提取各个剂量组和染F时间段的mRNA进行逆转录,然后采用荧光实时定量PCR的方法,对各个剂量组和染F时间段的mRNA进行相对定量。结果:1)Osx蛋白的检测结果:①与对照组相比:染F 12和48h,0.0001和1mg/L剂量组Osx表达量升高比较明显（p<0.05）;染F 24h,0.0001、0.01和0.1 mg/L剂量组Osx表达量明显升高（p<0.05）;染F 72h,1和10mg/L剂量组Osx表达量明显升高（p<0.05）;染F 96h,仅在0.001mg/L剂量组Osx表达量明显升高（p<0.05）;②与8h相比:染F 12h的0.0001和1mg/L剂量组和染F 48h的1mg/L剂量组Osx表达量明显升高（p<0.05）;染F 24h时几乎所有剂量组的Osx表达量均明显升高（p<0.05）;染F 72～96h时大部分剂量组的Osx表达量均明显降低（p<0.05）;总的来看,在各染F剂量组Osx表达量在24h时达最高,其余剂量组,随着染F时间的延长Osx蛋白的表达量呈逐渐降低的趋势;2)Ocn蛋白的检测结果:①与0 mg/L组相比,染F 24h,0.001、0.1和10mg/L剂量组的Ocn浓度显著性增高（p<0.05）;染F 48～96h,10mg/L剂量组的Ocn浓度明显升高（p<0.05）;②与8h相比,染F 24h的大部分剂量组和染F 72h的10mg/L剂量组的Ocn浓度呈明显升高（p<0.05）;染F 48～96h,各剂量组中的Ocn浓度呈明显下降趋势;总的来看,各剂量组的Ocn浓度随着染F时间的延长有降低的趋势,个别剂量组在24h时则明显上升;3)Osx mRNA基因的检测结果:染F 24和48h时,各个剂量组Osx mRNA的转录水平均呈增高趋势,尤其在1和10mg/L剂量组中增加比较明显（p<0.05）;染F 72h时Osx mRNA的转录水平总体呈现下降趋势,仅在1和10mg/L剂量组转录水平有所增加;4)Ocn mRNA基因的检测结果:染F 24h,Ocn mRNA的转录水平较对照组明显增高（p<0.05）;染F 48h,各剂量组的Ocn mRNA转录水平总体呈现先下降后升高的趋势;染F 72h,各个剂量组Ocn mRNA的转录水平则呈现先升高后下降的趋势,但Ocn mRNA的转录水平均较对照组高。结论:1)F可促进Osx和Ocn基因在FBEF的转录和表达,而且Osx和Ocn基因的转录和表达呈现时间-效应关系,24h的0.0001mg/L剂量组和48h的1mg/L剂量组是引起Osx蛋白表达的最佳条件,引起Osx mRNA转录的最佳时间-剂量则为24h和48h的10mg/L剂量组;2)染F可刺激FB向OB的转化,并促进Osx基因的转录和表达,并进一步促进成骨标志性基因Ocn的转录和表达,Osx基因可能是FBI骨周化骨过程中重要的调控基因。第三部分锌指结构转录因子Osterix和核心转录因子Cbfα1在不同职业性氟负荷人群中的检测目的:在蛋白表达水平上,观察Osx和Cbfα1在不同职业性F负荷人群中的表达,探讨Osx和Cbfα1在FBI骨周化骨中的作用机制。方法:选取湖北某铝业集团连续工作5年以上的男性工人为研究对象,然后根据F负荷（血F和尿F浓度）将观察对象分为三组:对照组（血F<0.16mg/L且尿F<2mg/L）,低F负荷组（0.16mg/L≤血F<0.25mg/L且2mg/L≤尿F<4mg/L）和高F负荷组（0.25mg/L≤血F且4mg/L≤尿F）,采用Elisa法分别检测血清Osx和Cbfα1的含量。结果:1)血氟和尿氟检测结果:中F负荷组和高F负荷组的尿F浓度与对照组相比明显升高（p<0.05）,而血清F仅在高F负荷组升高较明显（p<0.05）;与中F负荷组相比,高F负荷组的血清F和尿F均明显升高（p<0.05）;2)血清Osx和Cbfα1检测结果:①与对照组相比,中F负荷组的血清Osx浓度明显升高（p<0.05）,而血清Cbfα1升高却不太明显;②与中F负荷组相比,高F负荷组血清Osx和Cbfα1的浓度均明显降低（p<0.05）。结论:Osx和Cbfα1基因可能是FBI骨周化骨过程中两个比较重要的调控基因,而且血清Osx变化较Cbfα1更明显,在成骨过程中更具特异性。因此,可以初步推测血清Osx和Cbfα1可能是FBI早期损伤诊断的参考指标,尤其是Osx可能是FBI骨周化骨过程中重要的调控点之一。

论文目录

• 全文缩写词
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 不同染氟剂量组和染氟时间段染氟成纤维细胞的增殖活性
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二部分 锌指结构转录因子Osterix 和骨钙素在染氟成纤维细胞中的表达
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三部分 锌指结构转录因子Osterix 和核心转录因子Cbfα1 在不同职业性氟负荷人群中的检测
• 1. 内容与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 结论
• 研究展望
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 附录
• 硕士研究生期间工作小结
• 致谢