抑制补体激活对脓毒症大鼠作用的实验研究

论文摘要

目的本实验拟采用盲肠结扎穿孔术（CLP）复制脓毒症大鼠模型,通过使用补体抑制剂眼镜蛇毒因子（CVF）抑制补体激活后观察脓毒症大鼠早期外周血细胞因子释放及肺组织的变化,探讨抑制补体激活对脓毒症大鼠模型所产生的影响及意义。方法1.动物分组将144只清洁级雄性SD大鼠按随机数字表法随机分为假手术组（A组）、脓毒症组（B组）和CVF组（C组）三组,每组48只。各组按照标本采集点的不同又分为术后2、4、8、12、16、24小时六个时间点亚组,每个时间点亚组8只,采集标本结束后处死。假手术组动物仅开腹翻动盲肠后关腹并复苏,不结扎穿孔盲肠,脓毒症组和CVF组均行盲肠结扎穿孔术（CLP）复制脓毒症模型。CVF组于术前24小时经大鼠阴茎背静脉注射CVF 50μg/kg,假手术组和脓毒症组则给予等量生理盐水。2.实验动物模型制备采用盲肠结扎穿孔术（CLP）复制大鼠脓毒症模型。步骤为:用质量分数为3%的戊巴比妥钠按1ml/kg腹腔注射麻醉大鼠成功后固定,腹部常规脱毛、消毒、铺巾,沿腹正中线作一长约1.5cm的切口,找到盲肠后将粪便由升结肠挤入到盲肠,在远离回盲瓣的盲肠根部用不吸收缝合线结扎。使用20号针头在盲肠上贯穿2次,挤出肠内容物少许,形成盲肠漏,并于近端贯通处留置一条宽0.5cm长3.0cm橡皮条,防止针孔闭合,同时剪除适量腹膜避免包裹,然后将盲肠还纳腹腔,逐层缝合腹壁切口,术毕立即皮下注射60ml/kg生理盐水以补偿术中体液丢失并抗休克。术后动物置笼内自由活动,不禁饮食。3.抑制补体激活对脓毒症大鼠一般状况的影响观察各组大鼠活动、饮食、竖毛、呼吸、反应、腹腔变化、肺脏及胸腔积液变化等一般情况。4.抑制补体激活对脓毒症大鼠外周血细胞因子释放的影响各组于术后2、4、8、12、16、24小时等六个时间点采集外周血标本,采用放射免疫分析法检测大鼠血清TNF-α、IL-6等细胞因子的水平变化,采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测细胞因子IL-10的水平变化,观察抑制补体激活对脓毒症大鼠外周血细胞因子释放的影响。5.抑制补体激活对脓毒症大鼠肺组织髓过氧化物酶的影响通过采集肺组织标本检测肺组织的髓过氧化物酶（MPO）水平间接反映中性粒细胞在肺组织内的聚集和浸润情况。6.抑制补体激活对脓毒症大鼠肺组织病理学改变的影响通过采集肺组织标本制作光镜和电镜切片观察肺组织的病理学变化情况,结合肺组织髓过氧化物酶监测的肺组织内的中性粒细胞聚集情况探讨抑制补体激活对脓毒症大鼠肺组织的作用及意义。结果1.三组大鼠的脓毒症反应有区别B组大鼠脓毒症反应最强,C组明显减轻,A组没有相关表现或表现轻微。2.抑制补体激活对脓毒症大鼠外周血细胞因子释放有影响（1）TNF-α三组大鼠术后TNF-α迅速升高,2h后迅速下降,之后分别再次升高,B组除8h点外其余时间点均明显高于A组及C组（P< 0.05或P< 0.01）。（2）IL-6三组术后IL-6水平均迅速上升,于4h达到顶峰,然后迅速下降,B组明显高于A组及C组（P< 0.05或P< 0.01）。（3）IL-10B组术后IL-10一直处于较低水平,而C组除2h和24h外,其余时间点均明显高于B组（P< 0.05或P< 0.01）。3.抑制补体激活对脓毒症大鼠肺组织髓过氧化物酶有影响A组肺组织MPO水平术后一直处于较低水平,而B组和C组则迅速升高,除2h外,其余时间点均显著高于A组（P<0.05或P<0.01）,但C组显著低于B组（P<0.05或P<0.01）。4.抑制补体激活对脓毒症大鼠肺组织病理学改变有影响肺组织病理学改变提示B组损伤最严重,C组较之明显减轻。结论1.补体抑制剂CVF可明显降低补体激活介导的TNF-α、IL-6等促炎细胞因子的过度释放,同时可以相对增加抗炎细胞因子IL-10的释放,从而有效维持体内细胞因子的平衡。2.补体抑制剂CVF可以明显减轻中性粒细胞于肺内的聚集和浸润,并有效减轻肺组织的损伤,显示出对肺组织良好的保护作用。3.TNF-α出现的“双峰现象”说明在脓毒症早期,机体免疫状态有可能在不断发生变化,一定程度上为免疫平衡理论及脓毒症时免疫手段介入治疗的时机等问题提供了有力的佐证。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 引言
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 实验动物分组及给药
• 2.2.2 实验动物模型制备
• 2.2.3 标本的采集与处理
• 2.2.3.1 血标本的采集与处理
• 2.2.3.2 组织标本的采集与处理
• 2.2.4 监测指标和方法
• 2.2.4.1 细胞因子的测定
• 2.2.4.2 肺组织髓过氧化物酶测定
• 2.2.4.3 肺组织病理检查
• 2.2.5 统计学处理
• 第三章 结果
• 3.1 大鼠一般情况
• 3.2 大鼠腹腔解剖观察
• 3.3 大鼠肺脏及胸腔积液大体观察
• 3.4 各组血清细胞因子水平的变化
• 3.4.1 血清TNF-α水平变化
• 3.4.2 血清IL-6 水平变化
• 3.4.3 血清IL-10 水平变化
• 3.5 肺组织髓过氧化物酶水平变化
• 3.6 肺组织病理学变化
• 3.6.1 光镜下形态学变化
• 3.6.2 电镜下肺组织超微结构变化
• 第四章 讨论
• 4.1 补体激活与脓毒症的关系
• 4.2 补体抑制剂——眼睛蛇毒因子（CVF）
• 4.3 实验动物模型的选择
• 4.4 抑制补体激活对细胞因子的影响
• 4.5 抑制补体激活对肺组织的影响
• 第五章 结论
• 第六章 几点思考
• 6.1 动物模型的局限性
• 6.2 实验设计的不足
• 6.3 实验结果的不足
• 6.4 补体抑制剂的选择
• 6.5 展望
• 致谢
• 参考文献
• 文献综述
• 抑制补体激活对脓毒症影响的研究进展
• 参考文献
• 附录一 实验动物模型制备过程
• 附录二 采集标本
• 附录三 腹腔观察图片
• 附录四 肺脏大体观察图片
• 附录五 光镜图片
• 附录六 电镜图片
• 攻读学位期间发表的学术论文