草酸青霉菌P8（Penicillium oxalicum）的GFP和潮霉素抗性基因标记及其作物根际定殖的研究

论文题目: 草酸青霉菌P8（Penicillium oxalicum）的GFP和潮霉素抗性基因标记及其作物根际定殖的研究

论文类型: 硕士论文

论文专业: 微生物学

作者: 张磊

导师: 黄为一,范丙全

关键词: 草酸青霉菌,溶磷菌株,绿色荧光蛋白,原生质体,根际定殖,激光共聚焦扫描显微镜

文献来源: 南京农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 草酸青霉菌P8(Penicillium oxalicum)由中国农科院土肥所菌种保藏中心范丙全从土壤中分离获得。在温室盆栽条件下施用P8能有效溶解土壤中难溶磷，对花生、油菜、玉米等作物都产生明显的促生作用。本试验用GFP(Green Fluorescent Proten)和潮霉素抗性的双标记载体标记溶磷菌株草酸青霉菌P8，筛选稳定、高效表达GFP并对潮霉素产生抗性的双标记转化菌株，应用激光共聚焦显微镜原位观察研究其在作物根际的空间分布、繁殖和存活能力。主要研究内容如下： (一)应用基因重组技术，利用真核表达载体pNOM102作为重组质粒的骨架载体，将潮霉素抗性和加强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因装在强基因表达信号GPD(3-磷酸甘油醛脱氢酶)启动子和TtrpC中止子表达框之间，构建了用于标记草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)P8丝状真菌表达载体pHYGEGFP。 (二)对草酸青霉菌P8的原生质体形成和再生条件进行研究。从制备P8孢子悬液开始，对菌龄、破壁酶系统、渗透压稳定剂种类及浓度、酶解时间和温度、再生培养基等影响原生质体形成和再生的主要因素进行了研究，总结出一套高效制备草酸青霉菌原生质体的方法，得出青霉菌P8菌株原生质体形成的最适宜条件是：菌龄18h，25mg/mL的蜗牛酶和纤维素酶混合酶体系，pH为6.0的0.6mol/L NaCl的渗透压稳定剂，酶解2.5～3h，原生质体产量可以达到10~6～10~7cfu/mL；用平板稀释法以0.6mol/L NaCl、0.8％琼脂的CM培养基培养原生质体上，再生率最高达60％以上。 (三)质粒DNA pHYGEGFP经PEG介导转化青霉菌P8原生质体，筛选出高效、稳定表达潮霉素B抗性和绿色荧光蛋白基因的5株青霉菌转化菌株；转化菌株与野生型菌株P8的形态学特征和生理学特征经微生物学方法分析没有明显差异。青霉菌P8导入外源基因后并不影响其高效溶磷能力。继代转接和Southern杂交分析表明，外源DNA非特异整合到真菌的基因组DNA上，随宿主菌的转代而稳定遗传。 (四)利用激光共聚焦扫描显微镜可观察到土壤中P8-b的绿色菌丝和分生孢子。用激光共聚焦显微镜原位观察青霉菌P8-b在玉米根际的定殖状况，表明P8-b可在玉米生长繁殖并稳定定殖于玉米的根际；青霉菌P8-b在营养物质丰富的种子胚乳表面及根表上部根段定殖较好。 (五)温室条件下研究了不同栽培条件对青霉菌P8-b定殖的影响。青霉菌P8-b在玉米、大豆、棉花、小麦、花生不同类型作物根际都能生存定殖。根际定殖数量最高达10~5～10~6cfu/g土，玉米根际定殖数量最多，棉花根际定殖的P8-b数量最少。研究

论文目录:

摘要

Abstract

缩略语表

文献综述

第一节 溶磷微生物研究概况

1.土壤磷素状况

2.溶磷微生物(P-solubilization microorganisms,PSMs)

3.溶磷微生物对植物的促生作用

4.我国溶磷微生物研究和应用状况

5.溶磷微生物的根际定殖

第二节 应用于微生态学的分子生物技术

1.微生物根际定殖的研究方法

第三节 绿荧光蛋白在分子微生态学中的应用

1.绿色荧光蛋白的发现、基本结构及性质

2.GFP在研究开放环境中微生物的应用

第四节 丝状真菌的遗传转化

1.研究概况

2.丝状真菌遗传转化

3.丝状真菌转化方法

4.丝状真菌遗传转化的特点

5.丝状真菌基因转化系统的研究目标

本研究的目的和意义

拟研究内容

第一章 含GFP基因的丝状真菌表达载体构建

1.材料与方法

1.1 材料

1.2 试验方法

2.实验结果

2.1 DNOM102和酶切的电泳

2.2 目的基因的扩增

2.3 目的基因的TA克隆

2.4 PCR产物的测序

2.5 重组质粒的酶切结果

3.讨论

4.小结

第二章 青霉菌P8原生质体的制备

1.材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验方法

2.结果与分析

2.1 不同酶体系对青霉菌P8原生质体释放的影响

2.2 不同菌龄对原生质体形成的影响

2.3 不同种类和浓度的渗透压稳定剂对原生质体形成的影响

2.4 酶解时间对原生质体释放的影响

2.5 酶解温度和pH对原生质体制备的影响

2.6 不同条件对原生质体再生的影响

3.讨论

4.小结

第三章 PEG介导转化草酸青霉菌(Penicillum oxalicum)P8原生质体

1.材料和方法

1.1 试验材料

1.2 试验方法

2.结果与分析

2.1 潮霉素B对青霉菌P8的抑制

2.2 琼脂浓度对潮霉素B抑菌的影响

2.3 高浓度无机盐对潮霉素B抑菌的影响

2.4 筛选稳定转化子

2.5 野生型菌株和转化菌株生理生态学比较

2.6 转化菌株与野生型菌株在固体培养基上的溶磷能力比较

2.7 转化菌株表达外源基因的稳定性

2.8 杂交结果分析

3.讨论

4.小结

第四章 GFP标记草酸青霉菌P8-b在玉米根际定殖的研究

1.材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验方法

2.试验结果与分析

2.1 转化菌株P8-b在实验室条件下玉米根际的定殖

2.2 温室盆栽条件下青霉菌P8-b在作物根部的定殖

3.讨论

4.小结

第五章 不同盆栽条件下青霉菌P8-b在土壤中的定殖能力

1.实验材料和方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.3 根际微生物的检测方法

1.4 试验设计

2.试验结果

2.1 不同作物根部菌株P8-b定殖数量随时间的动态变化

2.2 不同土壤类型对青霉菌株存活的影响

3.讨论

4.小结

全文总结

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表论文

发布时间: 2006-10-20

参考文献

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• [3].小麦全蚀病生防细菌的筛选鉴定及其在小麦根际定殖的研究[D]. 郑青松.南京农业大学2014
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• [7].一株矿物分解细菌在水稻上的定殖及其对矿物风化的作用[D]. 张树奎.南京农业大学2011
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• [9].阿特拉津降解菌Arthrobacter sp.DNS10在黑土中定殖能力与基因表达情况研究[D]. 南超.东北农业大学2015

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