论文摘要
肺癌是全球死亡率最高的恶性肿瘤。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占所有肺癌病例的85%左右。以铂类为基础的两药联合化疗是晚期NSCLC的一线标准治疗方案,其中位无进展生存（progression free survival, PFS）仅有5个月左右。分子靶向药物的出现,为肺癌的治疗带来了很大的希望。对于上皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）敏感突变患者,EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI）的有效率达71.2%,现已成为EGFR敏感突变型晚期NSCLC患者的一线用药。EGFR-TKI用于二线或三线治疗时也优于最佳支持治疗。但是几乎所有的患者最终都不可避免的出现耐药,EGFR-TKI原发耐药或继发耐药的现象大大限制了其在临床的应用。现已报导的与EGFR-TKI耐药有关的机制包括T790M二次突变、MET扩增、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor, HGF）过表达[8]以及KRAS突变[9,’0]等。Hedgehog （Hh）信号通路是胚胎期的重要信号通路之一,调节细胞增殖、分化、上皮间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition, EMT）以及干细胞维持,以使组织器官正常发育。Hh信号通路在成人组织中的异常激活与多种肿瘤的形成、自我更新及耐药有关,这其中包括肺癌。不断有证据表明恶性肿瘤中EMT可导致肿瘤细胞迁移侵袭能力增加,并对传统的治疗方法产生耐药。癌干细胞样细胞（cancer stem-like cell, CSC）是另外一个导致肿瘤复发耐药的原因。最近有研究显示肿瘤在EMT诱导过程中会产生大量CSC[14]。而Hh信号通路通过其下游的直接靶基因Snail及ABCG2等对肿瘤中的EMT过程及CSC进行着紧密调节。现已有多个Hh信号通路抑制剂进入Ⅰ期和Ⅱ期的临床试验,并在皮肤基底细胞癌的治疗中取得了良好的结果。在胚胎期,Hh信号通路和EGFR信号通路在脑干细胞的增殖过程中具有协同作用。因此我们推测,在NSCLC中,Hh信号通路的异常激活有可能代偿性减弱了EGFR-TKI的治疗效果。Hh信号通路抑制剂与EGFR-TKI的联合应用或许可以有效提高原发或继发耐药患者对EGFR-TKI的反应性。本课题以具有EGFR-TKI敏感突变、继发耐药突变和原发耐药突变的NSCLC细胞作为体外实验模型,系统检测了EGFR-TKI敏感、继发耐药及原发耐药NSCLC中Hh信号通路的活性差异,论证了Hh信号通路对EGFR-TKI敏感性的影响,并对Hh抑制剂和EGFR-TKI联合用药的效果进行了评价。第一章Hedgehog信号通路在非小细胞肺癌癌与癌旁组织表达差异方法首先采用实时荧光定量PCR的方法对20对配对的NSCLC肿瘤组织和癌旁组织中的Hh信号通路分子PTCH1、PTCH2、SMO、GLI1、GLI2及GLI3的表达差异进行比较。应用SPSS13.0进行统计分析。计量资料采用均数±标准差表示。先对数据进行正态及方差齐性检。因所有分子的表达均符合正态分布及方差齐,两组间差异的比较用配对样本t检验或两独立样本t检验,多组间差异的比较用one-way ANOVA,各组间两两比较采用LSD法。两组数据的相关性分析如为正态分布者采用Pearson相关,如不符合正态分布者用spearman相关进行分析。对不同组间生存差异的比较采用Kaplan-Meier生存分析以及log-rank检验进行分析。P<0.05被认为差异有统计学意义。结果1患者的临床病理学特征：本次研究是一个小样本的初步研究,共有20对患者的癌与癌旁组织的配对样本。所有患者全部为病理学证实的肺腺癌。早期（Ⅰ-Ⅱ期）和晚期（Ⅲ-Ⅳ期）患者各10例。有6例经直接测序法证实为EGFR突变,2例为KRAS突变,5例为野生型,另外有7例基因状态未检测。2Hh信号通路分子在肺腺癌中的表达均较正常肺组织低。正态性检验的结果显示,各分子的表达均符合正态分布,用配对样本t检验对癌与癌旁组织的表达差异进行分析,结果显示SMO在癌与癌旁组织中的表达差异无显著性（t=-0.689, P=0.499）, PTCH1（t=-7.764, P<0.001）、PTCH2（t=-2.806, P=0.011）、 GLI1（t=-3.725, P=0.001）、GLI2（t=-4.648,P<0.001）及GLI3（t=-8.124,P<0.001）在癌与癌旁肺组织的表达有显著性差异,均为癌旁组织较癌组织的表达高。3仅少数肺腺癌中有Hh信号通路的异常激活。GLI1的过表达是比较公认的Hh信号通路激活的标志。我们的分析显示仅有1例标本（5%）的GLIl表达水平在肿瘤组织较癌旁组织上调2倍以上。这是1例有EGFR突变的早期肺癌患者。此外还有4例标本（20%）的SMO表达水平在肿瘤组织较癌旁组织上调2倍以上,这4例患者中,2例为早期患者,其中1例有EGFR突变,另一例基因状况未知；2例为晚期患者,基因状态均为EGFR野生型。这4例标本中有1例早期病例同时有GLI2的上调,EGFR基因状态未知；有1例晚期病例同时有PTCH2的上调,基因状态为EGFR野生型。4肿瘤组织中Hh信号通路基因表达与临床病理因素的关系（1）统计学分析显示肿瘤组织中GLI2表达水平在早期和晚期肺癌中有显著差异（t=2.579,P=0.019）,在早期肺癌中的表达较晚期肺癌高。其它基因表达水平在不同性别、吸烟与否、不同分期及不同基因状态中均无显著性差异。GLI1和GLI3表达水平在早期和晚期肺癌比较的P值分别为0.114和0.164,虽然由于样本量较小,差异性不显著,但是GLI1和GLI2有在早期肺癌较晚期肺癌表达高的趋势。此外,在不同基因状态下各分子表达水平差异的比较中,GLI1的P值为0.132,我们用LSD法对各组间GLI1的表达差异进行两两比较,结果发现野生型与EGFR突变型无显著性差异（P--0.206）；野生型与KRAS突变型也无显著性差异（P=0.297）；但EGFR突变型vs KRAS突变型,差异有边缘统计学意义（P=0.059）,GLI1在KRAS突变型肺癌中的表达水平较EGFR突变型的表达水平高。因为年龄和肿瘤体积不符合正态分布,我们用spearman秩相关进行分析的结果显示各基因表达水平与年龄无相关性,SMO表达与肿瘤体积呈正相关（r=0.560,P=0.010）。（2）我们以Hh信号通路基因在癌组织中表达的中位数为截断值,将患者分为高表达和低表达组,每组各有10例患者,行Kaplan-Meier生存分析及log-rank检验。结果显示GLH和GLI3高表达组患者的总生存均显著较低表达组高。因为GLI1高表达组的10例患者中有7例存活,因此未达到中位生存时间,低表达组中位生存时间为306天（Log-rank test,χ2=3.957, P=0.047,95%CI:130.9-481.1）; GLI3高表达组的10例患者中也有7例存活,因此未达到中位生存时间,低表达组中位生存时间为306天（Log-rank test,/=4.003, P=0.045,95%CI:0-794.1）。结论总体上Hh信号通路分子在肺腺癌组织中的表达较正常肺组织低；Hh信号通路仅在少数肺腺癌中有异常激活。第二章EGFR-TKI敏感与耐药非小细胞肺癌细胞中Hh信号通路的活性差异方法用细胞免疫化学法、组织免疫化学法及Western blot的方法,检测EGFR-TKI敏感突变、继发耐药突变及原发耐药突变的细胞及组织中Hh信号通路活性。应用SPSS13.0进行统计分析。计量资料采用均数±标准差表示。首先对数据进行正态及方差齐性检验。Western blot灰度分析的数据均符合正态分布。方差齐者,各组间蛋白表达的差异用one-way ANOVA,各组间两两比较用LSD法；方差不齐者各组间蛋白表达的差异用近似F检验welch法,各组间两两比较采用Dunnett’s T3法。多组间等级资料的比较使用Kruskal-Wallis H检验,等级资料的相关性分析采用spearman相关分析。P<0.05为有统计学意义。结果1Hedgehog （Hh）信号通路在EGFR-TKI耐药细胞中异常激活如前所述,GLI1表达通常被认为是Hh信号通路激活与否的标志。首先用细胞免疫组化法检测了GLI1在EGFR-TKI敏感和耐药细胞中的表达及定位。结果显示在EGFR-TKI高度敏感细胞系PC9中,GLI1的表达是阴性的。但是在EGFR-TKI耐药细胞系A549和H1975中GLI1表达阳性。GLI1在A549和H1975的细胞核表达阳性,提示Hh信号通路在这两个EGFR-TKI耐药细胞系中高度激活,但是在EGFR-TKI敏感细胞系PC9中则处于沉默状态。Western blot再次验证了GLI1在EGFR-TKI耐药细胞系A549和H1975中的表达水平显著较EGFR-TKI敏感细胞PC9高。进一步证明了Hh信号通路在EGFR-TKI敏感和耐药细胞中的活性存在明显差异,与EGFR-TKI敏感细胞相比,Hh信号通路在EGFR-TKI耐药细胞中高度激活。2EGFR-TKI耐药细胞中Hh信号通路的高度激活伴随EMT表型和ABCG2的上调E-cadherin表达下调或丢失是EMT的标志。以前的研究显示Hh信号通路通过上调Snail而使E-cadherin的表达下调来调节EMT表型。此外干细胞标志蛋白ABCG2也是Hh信号通路的直接靶基因[16]。为了进一步阐明Hh信号通路在EGFR-TKI敏感和耐药细胞中的差异,我们用western blot的方法对Hh信号通路的这几个靶基因的表达进行了检测。结果显示与EGFR-TKI耐药细胞A549和H1975的表达相比,在EGFR-TKI敏感细胞PC9中Snail的表达显著下调,E-cadherin的表达则显著上调,而在EGFR-TKI耐药细胞A549和H1975中几乎看不到表达。ABCG2的表达在EGFR-TKI耐药细胞A549和H1975中上调,尤以在A549细胞中上调最为明显,这与GLIl在各细胞系中的表达趋势相同。这些结果表明Hh信号通路在EGFR-TKI耐药细胞中的异常激活同时伴有EMT表型的出现和ABCG2的上调。3EGFR-TKI敏感和耐药NSCLC组织标本中的Hh信号通路活性为进一步了解在EGFR-TKI敏感和耐药的NSCLC组织中Hh信号通路活性是否存在差异,我们选取了与PC9（EGFR敏感突变）、H1975（EGFR T790M继发耐药突变）和A549（KRAS突变）基因状态相对应的NSCLC肿瘤组织各4例,用免疫组织化学法（immunohistochemistry, IHC）检测了GLI1、ABCG2、 E-cadherin和Snail的表达。基因状态为EGFR19外显子缺失或21外显子L858R突变者,对EGFR-TKI敏感；基因状态为EGFR20外显子T790M突变者,对EGFR-TKI继发耐药（即在EGFR-TKI用药后产生的耐药）；基因状态为KRAS突变者,对EGFR-TKI原发耐药。在EGFR-TKI敏感和耐药突变的肿瘤组织中均可有GLI1的表达,由于样本量小,Kruskal-Wallis H检验的结果显示GLI1在各组间的表达无显著性差异（χ2=4.460,P=0.108）。但是GLIl的表达在EGFR-TKI敏感突变组织中的平均秩次为5.25,在继发耐药组织中的平均秩次为4.88,而在KRAS突变的原发耐药组织中的平均秩次为9.38,GLI1有在KRAS突变的原发耐药组织中表达更高的趋势,在KRAS突变组织中可能有更高的Hh信号通路活性。ABCG2表达在EGFR-TKI敏感突变组织中的平均秩次为5.13,在继发耐药组织中的平均秩次为6.00,在原发耐药组织中的平均秩次为8.38,差异无统计学意义（/=2.155, P=0.340）。E-cadherin表达在EGFR-TKI敏感突变组织中的平均秩次为8.00,在继发耐药组织中的平均秩次为5.75,在原发耐药组织中的平均秩次为5.75,差异无统计学意义（χ2=1.179,P=0.555）。Snail表达在EGFR-TKI敏感突变组织中的平均秩次为5.38,在继发耐药组织中的平均秩次为6.75,在原发耐药组织中的平均秩次为7.38,差异无统计学意义（χ2=0.838,P=0.658）。相关性分析的结果显示E-cadherin与Snail表达成显著负相关（r=-0.582,P--0.047）,这与细胞实验的结果一致。此外,GLI1与E-cadherin表达呈负相关（r=-0.408,P--0.188）,与Snail （r=0.327, P=0.300）和ABCG2（r=0.386,P=0.215）表达呈正相关,虽然由于样本量少,相关性无统计学意义,但趋势与细胞实验的结果一致。结论1Hh信号通路活性在EGFR-TKI敏感和耐药细胞中存在显著差异,在敏感细胞中处于沉默状态,在原发和继发耐药细胞中异常激活。2在EGFR-TKI耐药细胞中,Hh信号通路的异常激活同时伴有EMT表型和ABCG2上调。3在部分继发或原发耐药的NSCLC中有Hh信号通路的异常激活。Hh信号通路在KRAS突变的原发耐药中可能有更重要的作用。第三章Hedgehog信号通路上调对非小细胞肺癌细胞EGFR-TKI敏感性的影响方法用外源性SHH刺激EGFR-TKI敏感细胞PC9后0h、24h、48h检测其Hh信号通路活性,并用MTT法检测Hh信号通路活性上调后Gefitinib对PC9细胞增殖的影响。应用SPSS13.0进行统计分析。计量资料采用均数±标准差表示。首先对数据进行正态及方差齐性检验。细胞增殖实验的所有数据均满足正态分布,并方差齐,不同组间细胞增殖差异的比较采用析因设计的方差分析,各组间两两比较采用LSD法。Western blot灰度分析的数据均符合正态分布。方差齐者,各组间蛋白表达的差异用one-way ANOVA,各组间两两比较用LSD法；方差不齐者各组间蛋白表达的差异用近似F检验welch法,各组间两两比较采用Dunnett’s T3法。P<0.05为有统计学意义。结果1外源性SHH暴露使EGFR-TKI敏感细胞PC9中的Hh信号通路活性上调上一章的结果显示在PC9细胞中Hh信号通路处于沉默状态。因此我们用外源性的SHH细胞因子对PC9进行处理（N-SHH0.5ug/ml）后,在0h、24h、48h细胞免疫组化法和western blot对Hh信号通路活性进行检测。细胞免疫组化及Western blot的结果均显示,在经过外源性N-SHH处理24h和48h之后GLI1的表达显著上调,Hh信号通路的活性显著增高。2Hh信号通路的上调使EGFR-TKI敏感细胞出现EMT表型并有ABCG2的上调为了了解Hh信号通路的激活是否可以导致EMT表型的出现以及ABCG2的上调,我们用western blot检测了经外源性SHH处理后Oh、24h、48h后E-cadherin、Snail和ABCG2的表达。结果显示E-cadherin在外源性N-SHH处理24h和48h后显著下调,而Snail的表达则逐渐上调。ABCG2的表达也在外源性N-SHH处理24h和48h后出现显著上调。这说明NSCLC细胞中Hh信号通路异常激活可使细胞产生EMT表型,并使ABCG2的上调。3Hh信号通路上调导致EGFR-TKI敏感细胞对EGFR-TKI敏感性下降经上述实验证明外源性的SHH可使EGFR-TKI敏感细胞中的Hh信号通路活性在24h后出现上调。因此我们先将EGFR-TKI敏感细胞PC9暴露在N-SHH （0.5ug/ml）24h后再用EGFR-TKI吉非替尼进行处理,然后再用MTT法检测细胞的增殖情况。结果显示实验组（外源性N-SHH暴露组）和对照组（未暴露组）间的细胞增殖有显著差异（F=76.677,P<0.001）,不同Gefitinib剂量组间的细胞增殖也有显著差异（F=32.785,P<0.001）。在低剂量组（Gefitinib20nM）,实验组和对照组的细胞增殖差异有边缘统计学意义（t=-2.700,P=0.054）,处理组的细胞增殖较对照组的细胞增殖高。在中剂量组（Gefitinib40nM）和高剂量组（Gefitinib80nM）,实验组的细胞增殖率均显著较对照组高（中剂量组和高剂量组t值和P值分为为t=-8.146,P=0.001和t=-6.855,P=0.002）,这些结果证明Hh信号通路异常激活可导致NSCLC细胞对EGFR-TKI产生耐受。结论Hh信号通路异常活化可诱导NSCLC细胞出现EMT表型,并使ABCG2表达上调,从而导致NSCLC细胞对EGFR-TKI耐受。第四章Hh信号通路抑制剂与EGFR-TKI联合应用对EGFR-TKI耐药细胞增殖能力的影响方法用western blot检测用Hedgehog信号通路抑制剂SANT-1处理后,EGFR-TKI耐药细胞中Hh信号通路活性,及ABCG2、EMT表型的变化。用细胞克隆形成实验和MTT法检测Gefitinib单药、Hh信号通路抑制剂SANT-1单药、或两药联用对EGFR-TKI耐药细胞增殖的影响。应用SPSS13.0进行统计分析。计量资料采用均数±标准差表示。首先对数据进行正态及方差齐性检验。克隆形成实验的所有数据均满足正态分布,并方差齐,不同用药处理对细胞克隆形成的影响用one-way ANOVA。细胞增殖实验的所有数据均满足正态分布,并方差齐,不同组间细胞增殖差异的比较采用析因设计的方差分析,各组间两两比较采用LSD法。Western blot灰度分析的数据均符合正态分布,方差齐者,各组间蛋白表达的差异用one-way ANOVA,各组间两两比较用LSD法；方差不齐者各组间蛋白表达的差异用近似F检验welch法,各组间两两比较采用Dunnett’s T3法。P<0.05为有统计学意义。结果1在EGFR-TKI耐药细胞中,Hh信号通路的抑制可反转EMT表型,下调ABCG2的表达,并抑制细胞的迁移能力。经过SANT-1处理24h后,A549和H1975这两个细胞系中的GLI1水平均明显下调,Snail的表达在两个细胞系中也显著减弱了。在SANT-1处理后48h,Snail在H1975中的表达几乎看不到。与Snail的表达相反的是,在经SANT-1处理后48h,在两个细胞系中E-cadherin的表达均上调。在经SANT-1处理后24h,在两个细胞系中,ABCG2的表达也均显著下调。这些结果表明在EGFR-TKI耐药细胞中,Hh信号通路的抑制可显著反转EMT表型,并上调ABCG2的表达。划痕实验的结果也显示经SANT-1处理48h后,EGFR-TKI耐药细胞的迁移能力显著减弱。2在EGFR-TKI耐药细胞中,Hh信号通路抑制剂与EGFR-TKI的联合应用可显著抑制细胞克隆形成能力在上面的研究中,我们证明了Hh信号通路抑制剂可以显著反转EMT表型,下调ABCG2表达,那么它是否可以通过这个机制来增加EGFR-TKI耐药细胞对EGFR-TKI的敏感性呢?首先我们用细胞克隆实验的方法检测Gefitinib单药、SANT-1单药、以及两药联用对细胞增殖的影响。结果显示在A549细胞系中,各组间克隆形成能力差异性显著（F=63.129,P<0.001）。经两两比较,结果显示无论是Gefitinib单独应用（P=0.120）,还是SANT-1单独应用（P=0.169）均不能有效抑制细胞的克隆形成能力；但是在两药联合应用组,克隆形成能力与对照组（P<0.001）、Gefitinib单药组（P<0.001）及SANT-1单药组（P<0.001）相比,差异均有显著性,两药联用可显著抑制细胞的克隆形成能力。在H1975细胞中,各组间克隆形成能力也有显著差异（F=23.114,P<0.001）。经两两比较结果显示Gefitinib单药组与对照组相比,克隆形成能力无显著性差异（P=0.069）；SANT-1单药组的克隆形成能力与对照组相比差异性显著（P=0.003）。两药联合组与对照组（P<0.001）、Gefitinib单药组（P<0.001）和SANT-1单药组（P=0.006）相比,克隆形成能力有显著差异。这些结果表明Gefitinib和SANT-1的联合应用可以有效的抑制EGFR-TKI耐药细胞A549和H1975的克隆形成能力。3Hh信号通路抑制剂与EGFR-TKI的联合应用可显著抑制EGFR-TKI耐药细胞的增殖以上克隆实验的结果提示我们Hh信号通路抑制剂与EGFR-TKI的联合应用有很强的协同。为了进一步证实这个结果,我们用MTT法检测Gefitinib单独应用、SANT-1单独应用、或者两药的联合应用对细胞增殖的影响。研究结果显示在A549细胞中,Gefitinib单药组、SANT-1单药组及两药联用组的细胞增殖率存在显著性差异（F=274.953,P<0.001）。两两比较的结果显示,Gefitinib单药和SANT-1单药相比对细胞增殖的影响无显著性差异（P=-0.689）,A549不但对Gefitinib耐药,而且对SANT-1也耐药。这与克隆形成实验的研究结果一致。但是两药联用组与Gefitinib单药或SANT-1单药相比,可显著抑制细胞增殖（Gefitinib+SANT-1vs Gfitinib单药P<0.001; Gefitinib+SANT-1vs SANT-1单药P<0.001）。在低剂量组（Gefitinib20nM, SANT-120uM）, Gefitinib单药、SANT-1单药及两药联用对细胞增殖影响的差异无显著性（F=0.503,P=0.628）；在中剂量组（Gefitinib40nM, SANT-140uM）三组间细胞增殖有显著性差异（F=77.787,P<0.001）,两两比较的结果显示Gefitinib单药对SANT-1单药差异无显著性（P=0.891）,但两药联用与Gefitinib单药或SANT-1单药相比,可显著抑制细胞增殖（Gefitinib+SANT-1vs Gfitinib单药P<0.001; Gefitinib+SANT-1vs SANT-1单药P<0.001）；在高剂量组（Gefitinib80nM, SANT-180uM）三组间差异性显著（F=303.919,P<0.001）,两两比较的结果显示Gefitinib单药对SANT-1单药差异无显著性（P=0.459）,但两药联用与Gefitinib单药或SANT-1单药相比,可显著抑制细胞的增殖（Gefitinib+SANT-1vs Gfitinib单药P<0.001；Gefitinib+SANT-1vs SANT-1单药P<0.001）。在H1975中,Gefitinib单药组、SANT-1单药组及两药联用组的细胞增殖存在显著性差异（F=638.881,P<0.001）。两两比较的结果显示SANT-1较Gefitinib可显著抑制细胞的增殖（P<0.001）；两药联用与Gefitinib单药和SANT-1单药相比,亦可显著抑制细胞的增殖（Gefitinib+SANT-1vs Gfitinib单药P<0.001；Gefitinib+SANT-1vs SANT-1单药P<0.001）。在低剂量组（Gefitinib20nM, SANT-120uM）, Gefitinib单药、SANT-1单药及两药联用对细胞增殖影响有显著性差异（F=98.107,P<0.001）两两比较的结果显示SANT-1单药与Gefitinib单药相比差异性显著（P<0.001）,两药联用与Gefitinib单药相比差异也有显著性意义（P<0.001）；但两药联用与SANT-1单药相比差异无显著性意义（P=0.154）;在中剂量组（Gefitinib40nM, SANT-140uM）三组间差异有显著性（F=154.647,P<0.001）,两两比较的结果显示Gefitinib单药对SANT-1单药差异性显著（P<0.001）,两药联用与Gefitinib单药或SANT-1单药相比,对可显著抑制细胞的增殖（Gefitinib+SANT-1vs Gfitinib单药P<0.001; Gefitinib+SANT-1vs SANT-1单药P=0.006）；在高剂量组（Gefitinib80nM, SANT-180uM）三组间差异性显著（F=488.201,P<0.001）,两两比较的结果显示Gefitinib单药对SANT-1单药差异性显著（P<0.001）,两药联用与Gefitinib单药或SANT-1单药相比,也可显著抑制细胞的增殖（Gefitinib+SANT-1vs Gfitinib单药P<0.001:Gefitinib+SANT-1vs SANT-1单药P<0.001）。结论阻断Hh信号通路活性可下调ABCG2表达,逆转其EMT表型,并显著抑制NSCLC细胞的迁移能力。Hh信号通路抑制剂与EGFR-TKI联用可协同性增加NSCLC对EGFR-TKI的敏感性,有效减少EGFR-TKI耐药细胞的增殖能力。全文结论本文以PC9细胞（EGFR19外显子缺失突变）、H1975细胞（EGFR20外显子T790M继发耐药突变）和A549细胞（KRAS突变）作为细胞模型,系统比较了EGFR-TKI敏感或耐药NSCLC细胞中Hh信号通路的活性差异。结果显示,在PC9细胞中,Hh信号通路处于沉默状态,而在EGFR-TKI耐药细胞H1975和A549中,Hh信号通路高度活化,并伴有EMT表型和ABCG2的上调。在与这三个细胞模型基因状态相对应的NSCLC组织中的检测结果显示,在部分EGFR-TKI继发耐药和原发耐药的NSCLC组织中有Hh信号通路的异常激活,尤其是在KRAS突变的组织中,显示出更高的Hh信号通路活性。用外源性SHH处理PC9细胞,使PC9细胞中的Hh信号通路活化,可发现Hh信号通路活化使PC9中的ABCG2的表达显著上调并有EMT表型出现,并且使PC9细胞对EGFR-TKI产生耐受。用Hh信号通路抑制剂对EGFR-TKI耐药细胞中的Hh信号通路阻断,可下调ABCG2表达、反转EMT表型,并抑制细胞的迁移能力。与Hh或EGFR-TKI单药相比,Hh抑制剂与EGFR-TKI联用,可显著抑制EGFR-TKI耐药细胞的克隆形成和增殖能力,显示出良好的协同作用。在NSCLC细胞中,Hh信号通路的异常活化,导致ABCG2上调,诱导细胞产生EMT表型,从而使细胞对EGFR-TKI耐药。用Hh信号通路抑制剂阻断其活性,下调ABCG2表达,反转EMT表型,可显著增加NSCLC细胞对EGFR-TKI的敏感性。在人体NSCLC组织中,GLI1与E-cadherin表达呈负相关,E-cadherin或许可成为Hh抑制剂与EGFR-TKI在NSCLC中联合用药的一个预测指标。