血浆脂蛋白与病原细菌相互作用研究（Ⅰ）

论文摘要

运输脂类物质是血浆脂蛋白的基本作用。越来越多的报道显示血浆脂蛋白与微生物感染之间有重要的相互联系,血浆脂蛋白往往对微生物感染起到部分防御的作用。有大量证据说明高密度脂蛋白（high-density lipoprotein, HDL）是天然免疫的一部分,具有直接保护宿主,抗感染和炎症的作用。本研究偶然发现重组表达的M41型A群链球菌[group A Streptococcus （GAS）]的I型胶原样蛋白（streptococcal collagen-like protein 1,Scl1）能与HDL结合。Scl1是GAS表面的一种毒力因子。一些M型的GAS表达的Scl1可以与低密度脂蛋白（low-density lipoprotein, LDL）结合。为证实Scl1与HDL的相互作用,本研究从M41血清型A群链球菌（GAS）的两种菌株（MGAS6183、CMCC32198）中克隆了Scl1基因,构建了全长和不同截短的表达载体并在大肠杆菌BL21中表达和纯化。通过亲和色谱实验以及Western blot,Dot blot, ELISA实验证实了两种菌株来源的rScl1都可以通过N末端的可变区（variable regions,V区,含84个氨基酸）结合HDL,而截去V区N末端42个氨基酸或C末端42个氨基酸的rScl1,均不能与HDL结合,说明完整的V区结构在rScl1与HDL的结合中起重要作用。进一步研究发现Tween 20能抑制rScl1与HDL的结合,提示rScl1与HDL的结合可能是通过疏水相互作用。由于rScl1能同时结合HDL和LDL,因此,在制备无脂血清方面可能有潜在的用途。据我们所知,这是在国际上首次发现GAS M41的rScl1与HDL结合,但是这种HDL与GAS的相互作用在GAS致病性或机体抗感染中的作用还有待于深入的研究。目前,脂蛋白（a）[Lipoprotein（a）, Lp（a）]的生理功能仍然不清,但是Lp（a）的组成成分-载脂蛋白（a）[Apo（a）],与纤溶酶原（Plasminogen,Plg）有高度的相似性,因此可以假设Lp（a）很可能与细菌表面的Plg受体结合,从而抑制Plg与细菌的结合,最终抑制细菌对Plg的激活作用,阻碍细菌生长和穿越人体组织屏障,在一定程度上起到抵抗细菌感染的作用。为验证这一假设,本研究用柱层析技术从血浆中分离制备Lp（a）,并用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测Lp（a）与金黄色葡萄球菌是否结合。结果初步证明Lp（a）可与金黄色葡萄球菌的菌株CMCC26003结合,而且一定浓度的赖氨酸类似物6-氨基己酸（20mM）可以抑制金黄色葡萄球菌与Lp（a）结合,提示血浆Lp（a）有可能通过其Kringle结构域上的赖氨酸结合位点与金黄色葡萄球菌结合。将金黄色葡萄球菌与Plg以及Lp（a）共孵育,再加入尿激酶（uPA）,结果显示由于Lp（a）的加入,菌表面的纤溶酶活性降低,说明Lp（a）可抑制金黄色葡萄球菌对Plg的吸附。总之,本研究在国际上首次发现Lp（a）有可能与金黄色葡萄球菌结合并抑制金黄色葡萄球菌对Plg的吸附,这一发现初步证实了本研究室提出的Lp（a）抗感染假说,有助于更好地了解Lp（a）在抗感染中的作用,并且为防治病原细菌感染提供可能的新理念或技术手段。另外,本研究结果为本研究室提出的脂蛋白免疫学理论体系提供了支持和佐证。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 HDL 的结构和功能
• 1.1.1 血浆脂蛋白分类
• 1.1.2 HDL 的结构和功能
• 1.2 A 群链球菌胶原样蛋白
• 1.2.1 A 群链球菌及其致病因子
• 1.2.2 A 群链球菌胶原样蛋白
• 1.3 Lp（a）的结构和功能
• 1.3.1 Lp（a）的结构和代谢
• 1.3.2 Lp（a）的生理功能
• 1.3.3 Lp（a）的致病性
• 1.3.4 Lp（a）的分离纯化
• 1.4 金黄色葡萄球菌致病性及细胞表面的纤溶酶原受体
• 1.4.1 金黄色葡萄球菌致病性及毒力因子
• 1.4.2 金黄色葡萄球菌纤溶酶原激活剂及受体
• 1.5 立题依据
• 1.6 研究内容
• 第一部分 rScl1 与 HDL 的结合
• 2 M41 型A 群链球菌I 型胶原样蛋白通过疏水作用与高密度脂蛋白结合
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要仪器设备
• 2.1.2 主要试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 A 群链球菌CMCC32198 基因组DNA 的提取
• 2.2.2 DNA 的琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.3 C176 基因的扩增
• 2.2.4 C176 基因扩增产物的纯化
• 2.2.5 C176 DNA 片断的酶切及纯化
• 2.2.6 pASK-IBA2 载体的酶切及纯化
• 2.2.7 酶切C176 DNA 片段与pASK-IBA2 载体的连接
• 2.2.8 P176、C176 转化感受态E.coli BL21
• 2.2.9 菌落PCR 鉴定转化阳性的菌落
• 2.2.10 序列测定
• 2.2.11 工程菌培养
• 2.2.12 表达产物的SDS-PAGE 分析
• 2.2.13 重组P176 及C176 的纯化
• 2.2.14 蛋白浓度的测定
• 2.2.15 P176 及C176 与纯的的HDL 的亲和色谱实验（Pull down）
• 2.2.16 Dot blot 检测Pull down 结果
• 2.2.17 ELISA 检测P176、C176 与HDL 的结合
• 2.2.18 Tween 20 抑制P176，C176 与HDL 的结合
• 2.2.19 P176 及C176 与血浆的Pull down 实验
• 2.2.20 Western Blot 检测P176 及C176 与血浆的Pull down 实验
• 2.3 结果
• 2.3.1 pASK-IBA2-P176 及pASK-IBA2-C176 表达载体的构建
• 2.3.2 P176 及C176 蛋白的表达
• 2.3.3 P176 及C176 与HDL 的结合实验
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 3 M41 型A 群链球菌I 型胶原样蛋白与高密度脂蛋白结合的具体部位
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 C176V、P176T、C176T 目的基因的扩增
• 3.2.2 P176L1、P176L2 基因的扩增
• 3.2.3 DNA 片段的酶切及纯化
• 3.2.4 pASK-IBA2 载体的酶切及纯化
• 3.2.5 酶切后DNA 片段与pASK-IBA2 载体的连接
• 3.2.6 连接产物转化感受态E.coli BL21
• 3.2.7 菌落PCR 鉴定转化阳性的菌落
• 3.2.8 序列测定
• 3.2.9 工程菌培养
• 3.2.10 表达产物的SDS-PAGE 分析
• 3.2.11 重组蛋白的纯化
• 3.2.12 蛋白浓度的测定
• 3.2.13 P176V、C176V、P176T、C176T、P176L1、P176L2 与纯的的HDL 的亲和色谱实验（Pull down）
• 3.2.14 Dot blot 检测Pull down 结果
• 3.2.15 ELISA 检测P176V、C176V、P176T、C176T、P176L1、P176L2 与HDL的结合
• 3.2.16 统计学处理
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 C176V、P176T、C176T 目的基因扩增结果
• 3.3.2 P176L1、P176L2 基因的扩增
• 3.3.3 酶切、连接及转化结果的鉴定
• 3.3.4 序列测定结果
• 3.3.5 表达产物的SDS-PAGE 分析
• 3.3.6 重组蛋白的纯化
• 3.3.7 蛋白含量的测定
• 3.3.8 重组蛋白与HDL 的Pull down 实验
• 3.3.9 ELISA 检测rSc11 与HDL 的结合
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 4 M41 型 A 群链球菌 I 型胶原样蛋白在分离 HDL 及制备无脂血清中的潜在用途
• 4.1 实验材料
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 C176 的克隆、表达、纯化
• 4.2.2 用C176 吸附血浆脂蛋白
• 4.2.3 用C176 分离HDL
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 用C176 吸附血浆脂蛋白
• 4.3.2 用C176 分离HDL
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 4.6 第一部分的结论
• 第二部分 血浆LP（A）抑制金黄色葡萄球菌对PLG 的吸附
• 5 血浆LP（A）抑制金黄色葡萄球菌对PLG 的吸附
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果
• 5.2.1 Lp（a）分离纯化结果
• 5.2.2 金黄色葡萄球菌与 Lp（a）的结合
• 5.2.3 结合机制研究
• 5.2.4 Lp（a）抑制金黄色葡萄球菌吸附Plg 的实验
• 5.3 讨论
• 5.4 小结
• 6. 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 作者简介