论文摘要
目的：探讨新型光敏剂叶绿素衍生物B-CPD5对人乳腺癌细胞系MCF-7的体外光动力效应,及其与选择性环氧化酶-2抑制剂NS398的联合作用和相关机制的初步研究,从而为临床应用光动力治疗乳腺癌提供理论依据。方法：本研究以人乳腺癌MCF-7细胞系为研究对象,应用不同剂量的新型光敏剂B-CPD5对MCF-7细胞进行处理,以650nm波长半导体激光治疗仪给予不同能量密度照射,采用激光共聚焦荧光显微镜结合荧光探针标记技术观察光敏剂在细胞内的分布及亚细胞定位,采用MTT比色法从细胞学水平分析B-CPD5光动力疗法对肿瘤细胞生长抑制作用的剂量浓度关系,通过流式细胞术了解其对肿瘤细胞的促凋亡作用和光动力作用后MCF-7细胞的线粒体膜电位变化,应用Western-blot技术分析B-CPD5光动力作用后MCF-7细胞COX-2蛋白表达的变化情况及光动力作用后加NS398共同孵育24小时后MCF-7细胞中COX-2蛋白的表达,通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血管内皮生长因子（VEGF）和前列腺素E2 （PGE2）释放水平变化,以探究其可能的药物作用机制。结果：1.新型光敏剂B-CPD5可穿过细胞膜进入人乳腺癌MCF-7细胞中,分布在细胞膜及胞浆中,线粒体是其亚细胞分布的主要位点之一2.以MTT比色法检测不同浓度B-CPD5作用24小时及不同光照剂量对MCF-7细胞增殖的影响,发现同一能量密度下进行光动力照射,随光敏剂浓度增加,细胞增殖抑制率增大,光动力组0.5μg/ml、光动力组1μg/ml与光动力组2μg/ml比较差异有统计学意义；光动力组2μg/ml与光动力4μg/ml、光动力8μg/ml比较未见统计学差异；同一光敏剂作用浓度下,随能量密度增加,细胞增殖抑制率增大,能量密度1.2J/cm2与2.4J/cm2和3.6 J/cm2相比较均有明显统计学差异；能量密度2.4J/cm2与3.6J/cm2组比较未见统计学差异。可见,随光敏剂浓度和光照剂量增加至一定程度,细胞增殖抑制率增加变化不再明显,因此筛选出光敏剂浓度0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml,能量密度1.2J/cm2和2.4J/cm2作为后续实验研究参数。3.倒置显微镜细胞形态学观察,发现正常MCF-7细胞呈多边形,贴壁生长,繁殖速度快；细胞饱满、胞膜完整、边界清晰。随着光敏剂浓度的增大以及光照能量密度的提高,PDT组细胞形态学发生如下变化：细胞边界变圆,胞质内出现空泡、细胞膜边界不清、胞膜破裂、细胞溶解死亡；而空白对照组、单纯光敏剂组及单纯光照组细胞形态未见明显变化。4.流式细胞技术检测细胞凋亡实验,可见随光敏剂B-CPD5浓度增加,凋亡细胞所占比例逐渐增加。应用SPSS16.0软件对所得数据进行统计学分析,发现同一浓度B-CPD5作用下,随光照能量密度增强,光动力作用后24h细胞凋亡率增大（P<0.05）；相同光照能量密度下,随光敏剂B-CPD5浓度增加,细胞凋亡率逐渐增大（P<0.05）。5.流式细胞仪检测线粒体膜电位显示,空白对照组、单纯光敏剂组和单纯光照组线粒体膜电位变化未见明显差异（P>0.05）,而PDT组的线粒体膜电位降低比例与上述对照组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。6.通过Western-blot方法发现：B-CPD5光动力作用24小时后MCF-7细胞COX-2蛋白表达明显上调,B-CPD5光动力作用后加选择性COX-2抑制剂NS398孵育后MCF-7细胞COX-2表达未见明显上调。7. ELISA法检测MCF-7细胞培养上清中VEGF和PGE2释放水平发现：B-CPD5光动力作用24小时后MCF-7细胞培养上清中VEGF和PGE2释放水平与空白对照组、单纯光敏剂组及单纯光照组比较明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）,但B-CPD5光动力作用后加选择性COX-2抑制剂NS398孵育后MCF-7细胞培养上清中VEGF和PGE2释放水平明显降低。结论：1.新型光敏剂B-CPD5分布于人乳腺癌细胞系MCF-7的细胞膜和胞浆中,亚细胞定位主要分布于线粒体。2.新型光敏剂B-CPD5对人乳腺癌细胞系MCF-7有良好的体外光动力效应,其对乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制和促凋亡作用呈浓度-光照剂量依赖效应。3.新型光敏剂B-CPD5光动力作用于人乳腺癌MCF-7细胞24小时后,MCF-7细胞中COX-2蛋白表达上调,但可被选择性COX-2抑制剂NS398抑制。4.新型光敏剂B-CPD5光动力作用完成24小时后,人乳腺癌细胞MCF-7培养上清中VEGF和PGE2释放水平明显升高,同样可被选择性COX-2抑制剂NS398抑制。