MicroRNA-218经ROBO1通路调控胰腺癌侵袭和淋巴道转移的实验研究

论文摘要

目的寻找胰腺癌淋巴道转移相关的miRNAs,研究目标miRNA调控胰腺癌侵袭和迁移的机制,及其体内抑制胰腺癌淋巴道转移的效应。方法（1）采用miRNA表达谱芯片分别对PDAC与癌旁正常组织之间,以及胰腺癌高转移细胞克隆BxPC-3-LN与亲代胰腺癌细胞株BxPC-3之间的差异miRNAs进行筛选；荧光定量PCR验证目标miRNA在胰腺癌组织和胰腺癌细胞系中的表达；分析miRNA表达与临床病理因素间的关系；原位杂交实验以明确miRNA在PDAC、IPMN和癌旁正常石蜡组织中的原位表达特点；荧光定量PCR和Western Blotting实验来检测miRNA-218的靶基因在胰腺癌组织中的表达。（2）采用miRNA-218类似物Mimics-218瞬时转染胰腺癌细胞克隆BxPC-3-LN,上调细胞中miRNA-218的表达,研究miRNA-218对靶基因ROBO1的调控作用；通过荧光素酶基因报告实验以确定miRNA-218与靶基因ROBO1的调控位点；慢病毒Lenti-218稳转上调细胞中miRNA-218表达后,用质粒pcDNA3.1瞬时转染3’-UTR缺失的ROBO1以恢复该细胞内ROBO1的表达,通过Transwell侵袭实验和迁移实验研究miRNA-218是否通过ROBO1调控胰腺癌细胞的侵袭和迁移活动；免疫荧光实验检测miRNA-218调控后细胞骨架的变化；CCK-8实验和平板克隆形成实验研究miRNA-218对胰腺癌细胞增殖的影响。（3）采用Lenti-218稳转后miRNA-218表达上调的BxPC-3-LN细胞,在BALB/C裸小鼠上建立人胰腺淋巴道转移模型,研究体内环境中miRNA-218对胰腺癌淋巴道转移和生长的影响。结果（1）通过miRNAs表达谱研究,发现胰腺癌组织中有70个差异表达的miRNAs（相对于癌旁正常组织）,胰腺癌高转移细胞克隆BxPC-3-LN中有63个差异表达的miRNAs（相对于亲代胰腺癌细胞株BxPC-3细胞）,miRNA-663、miRNA-145、 miRNA-218和Let-7在胰腺癌和细胞克隆BxPC-3-LN中均出现异常表达,其中miRNA-218表达下降且差异最大（差异倍数>10）；荧光定量PCR检测发现miRNA-218在胰腺癌组织（P=0.001）和胰腺癌细胞克隆BxPC-3-LN中（P<0.001）均表达下降；胰腺癌发生淋巴结转移的病例,其原位癌组织中miRNA-218的表达相对更低（P=O.003）；胰腺癌细胞内的miRNA-218表达相对正常胰腺腺泡细胞和导管上皮细胞低,胰腺癌淋巴结转移灶内癌细胞的miRNA-218表达更低。miRNA-218靶基因ROBO1在胰腺癌组织中表达升高（P=0.0066）,其蛋白质表达相对癌旁正常组织也明显升高。（2）胰腺癌细胞克隆BxPC-3-LN中Mimics-218瞬时转染24hr、48hr和72hr后miRNA-218表达均明显升高（P值分别为<0.001、<0.001和0.001）,并抑制了ROBO1mRNA的表达（P值分别为0.002、0.002和0.006）和蛋白质的表达,miRNA-218与ROB01相互作用的位点在ROBO13’-UTR区域,长度为8个碱基（971-978）:Lenti-218稳转胰腺癌细胞克隆BxPC-3-LN后,miRNA-218表达上调抑制了ROBO1mRNA表达（P=0.002）和蛋白质表达,细胞的侵袭和迁移能力受到抑制（P值均<0.001）, pcDNA-muROBO1瞬时转染细胞后,逆转了miRNA-218的表达抑制作用使ROBO1表达上升（P<0.001）,细胞的侵袭和迁移能力相对提高（P值均<0.001）:miRNA-218表达升高导致细胞骨架密度下降以及细胞分布松散；miRNA-218高表达细胞的增殖能力受到缓慢的抑制,克隆形成率下降（P=0.004）。（3）Lenti-218转染组和Lenti-NC转染组细胞接种BALB/C裸小鼠爪垫2周后成瘤,两组肿瘤对动物体重的影响无差异；接种肿瘤40天后实验终止,Lenti-218转染组原位癌体积较Lenti-NC转染组小（P=0.001）:Lenti-218组胭窝淋巴结转移阳性率较Lenti-NC组低（P=0.007）,Lenti-218组腹股沟淋巴结转移阳性率与Lenti-NC组无显著差异（P=0.108）,两组裸小鼠髂动脉旁淋巴结均未检获阳性淋巴结,Lenti-218组总淋巴结转移率与Lenti-NC组无显著差异（P=0.083）。结论（1）miRNA-218在胰腺癌组织和胰腺癌高转移细胞克隆BxPC-3-LN中表达下降,miRNA-218下游靶基因ROBO1在胰腺癌组织中表达升高,两者呈负调控关系；（2）胰腺癌细胞克隆BxPC-3-LN中miRNA-218具有抑制ROBO1表达的作用,miRNA-218与ROBO1的调控位点明确；（3）miRNA-218通过ROBO1通路调控胰腺癌细胞侵袭和迁移；（4）miRNA-218体内对胰腺癌的淋巴道转移和生长均有抑制作用。

论文目录

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• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 胰腺癌淋巴道转移相关miRNAs的筛选及其靶基因的预测
• 1. 材料和方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 第二部分 MicroRNA-218通过ROB01通路调控胰腺癌细胞侵袭和迁移特性的研究
• 1. 材料和方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 第三部分 MicroRNA-218在人胰腺癌淋巴道转移模型中抑制肿瘤转移的作用研究
• 1. 材料和方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 小结
• 参考文献
• 人类胰腺癌表达谱研究
• 参考文献
• 在读期间发表论文
• 致谢