X射线在鲤鱼雌核发育研究中的应用

论文摘要

人工诱导雌核发育是鱼类遗传育种的重要途径之一,可以用于快速建立纯系,无性繁殖和克隆,保护濒危鱼类以及基因定位,性别控制等等,在水产养殖新品种培育方面和遗传学研究方面都有着广泛的应用。X射线是早期应用于鱼类辐射育种研究的诱变源,但早期有关X射线的应用研究均是初步的、定性的,缺乏系统性。此后,随着γ射线的兴起和紫外线的应用,X射线在鱼类中的应用研究停滞了20多年,特别是上世纪80年代至今,未见X射线应用于鱼类遗传育种研究方面的报道。本文拟以我国鲤鱼主养品种建鲤为试验对象,从温度、保存时间以及X射线对建鲤精子活力的影响,脉冲场凝胶电泳对DNA双链断裂的检测,X射线灭活精子和卵子染色体加倍相关技术参数优化等三个方面着手,对X射线诱导的鱼类雌核发育进行系统研究,以填补相关研究的空白,建立X射线诱导鱼类雌核发育技术。1温度、保存时间及X射线对建鲤精子活力的影响研究在不同温度、保存不同时间以及X射线照射对建鲤雄鱼精子活力的影响。方法（1）正常精液于温度4℃、10℃、15℃、20℃、25℃保存,观察保存时间对精子活力的影响;（2）X射线辐射过的精液于4℃保存,照射时间分别为0min,20min,30min,40min,50min,60min,70min和80min,观察保存时间对精子活力的影响。结果表明:（1）4℃～25℃保存的建鲤精子,随保存温度和保存时间的增加,激活率和活力都逐步下降,4℃保存效果最好。4℃保存34h,10℃保存8h,15℃、20℃和25℃保存2h内活力变化不显著;10℃保存到36h时,15℃保存到34h、20℃和25℃保存24h的精子全部失活并死亡。（2）X射线照射20～80min的精子,6h内活力变化不显著（P＞0.05）,此后随照射时间和保存时间的增加活力下降显著,人工授精实验表明在12h内保证足量的精液量,也具有较高的受精率。2脉冲场凝胶电泳对DNA双链断裂的检测脉冲场凝胶电泳（Pulsed-field gel electrophoresis,PFGE）技术是近年发展起来的分离大分子DNA的一种新型电泳技术,现已被认为是检测生物大分子DNA双链断裂的灵敏、可靠方法。本文应用脉冲场凝胶电泳技术,建立检测X射线诱发鱼类精子细胞DNA损伤效应的方法,并检测不同X射线照射剂量对鱼类精子细胞DNA的损伤效应,从分子水平上研究鱼类雌核发育所需最佳照射剂量与DNA损伤程度之间的关系以及鱼类生殖细胞的辐射敏感性。实验结果表明照射时间在0～90min,X射线引起的DNA双链断裂片段量随照射时间的增加而增加,DNA双链断裂量与照射时间呈良好线性正比关系。鱼类精子细胞是辐射敏感细胞,脉冲场凝胶电泳技术是分析鱼类精子细胞DNA双链断裂效应的有效方法。3 X射线诱导建鲤雌核发育的研究采用X射线照射处理的建鲤精子与正常建鲤卵授精,受精卵不经染色体加倍处理,筛选X射线最佳照射时间。X射线强度为100KV,5mA,源距10cm,照射时间为0、20、30、40、50、60、70和80min。随着照射时间的增加,在0～50min之间,孵化率呈逐步下降趋势,而在50～60min之间,孵化率又呈升高趋势,超过60min,孵化率又呈逐步下降趋势,受精卵的发育表现出典型的“Hertwig”效应,照射60min时,胚胎孵化率达到回升高峰（4.32%）,且孵出鱼苗100%畸形,表明X射线辐射精子遗传失活的有效性,确定60min为灭活鲤鱼精子和获得雌核发育单倍体的最佳照射时间。本文同时研究了染色体的加倍技术,根据以上实验结果,将照射时间固定为60min,受精后温度休克（冷休克和热休克）的方法诱导建鲤雌核发育二倍体。结果表明,冷休克（1.5℃）和热休克（40℃）条件下,用不同休克起始时间（受精后3min和6min）及处理持续时间（冷休克20min和热休克1.5min）均能诱导卵子染色体加倍。在同一休克起始时间条件下,在诱导孵出期胚胎存活率和孵化率方面,热休克处理效果优于冷休克,但在获得摄食期仔鱼方面,二者没有差异;在休克温度相同的条件下,休克起始时间以3min较好,在1.5℃条件下,受精后3min开始,冷休克处理20min,二倍体诱导率最高为1.22%,热休克处理1.5min二倍体诱导率最高为0.72%。本文首次对X射线诱导的雌核发育进行了较系统的研究,建立了稳定可靠的X射线诱导的鱼类雌核发育技术,同时建立了精子短期保存方法以及应用脉冲场凝胶电泳检测鱼类精子细胞DNA双链断裂技术,为X射线在鱼类遗传育种中的应用奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 辐射线在鱼类遗传育种中的研究与应用
• 1.1 辐射诱变育种
• 1.1.1 基本原理
• 1.1.2 研究现状
• 1.1.3 应用前景
• 1.2 单倍体育种
• 1.2.1 雄核发育
• 1.2.2 雌核发育
• 1.3 单倍体育种研究的目的和意义
• 1.3.1 快速建立纯系
• 1.3.2 基因定位
• 1.3.3 性别遗传机制分析
• 1.3.4 单性种群的利用
• 1.3.5 保护濒危鱼类
• 2 生物DNA辐射损伤的检测方法
• 2.1 碱洗提法
• 2.2 碱解旋法
• 2.3 单细胞凝胶电泳技术
• 2.4 脉冲场凝胶电泳技术
• 2.4.1 脉冲场凝胶电泳技术的原理
• 2.4.2 脉冲场凝胶电泳技术的发展及特点
• 2.4.3 脉冲场凝胶电泳技术在检测DNA双链断裂中的应用
• 3 结语
• 第二章 温度、保存时间及X射线对建鲤精子活力的影响
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 精液采集
• 2.2.2 精液照射
• 2.2.3 精子活力观察
• 2.3 精子群体运动阶段的划分
• 2.4 数据处理
• 3 结果
• 3.1 不同保存温度和保存时间对建鲤精子活力的影响
• 3.2 X射线不同照射时间及保存时间对精子活力影响
• 4 讨论
• 第三章 X射线诱发鱼类遗传物质损伤的脉冲场凝胶电泳检测
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验鱼
• 2.1.2 主要仪器和试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 精液采集
• 2.2.2 精液照射
• 2.2.3 精子细胞DNA的准备
• 2.2.4 电泳条件
• 2.2.5 电泳图像分析
• 3 结果
• 3.1 正交试验设计筛选脉冲场凝胶电泳最佳条件
• 3.2 不同剂量X射线诱发建鲤精子细胞DNA双链断裂的检测
• 4 讨论
• 第四章 X射线诱导建鲤雌核发育的研究
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 精液采集
• 2.2.2 精子的失活处理
• 2.2.3 冷休克和热休克的诱导条件
• 2.3 数据处理
• 3 结果
• 3.1 X射线不同照射时间对建鲤受精率和孵化率的影响
• 3.2 冷休克和热休克诱导雌核发育二倍体
• 4 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 附录:试验试剂及配制
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢