久效磷降解菌的分离、鉴定及降解酶基因的克隆

论文摘要

久效磷是一类剧毒有机磷杀虫剂，现已被许多国家禁用或限用，且被列入PIC（Prior Informed Consent，预先通知同意）公约。但由于该类农药杀虫效果好、见效快且价格便宜，在我国此类农药禁而不止的现象十分严重，由此引发的环境污染问题日益突出。有机磷化合物在环境中的归趋主要是通过微生物降解和转化。环境污染的微生物修复具有其它修复方法无可比拟的优势，因此如何开发利用参与环境净化的微生物资源，进一步充分有效地发挥其潜在的修复环境污染的能力，已成为人类生产活动中的重要课题。本研究的意义在于分离、筛选能够以久效磷作为唯一碳源生长的降解菌株，并对该菌株在各种环境条件下降解久效磷的特性进行研究，以期为久效磷环境污染的修复工作提供科学依据；同时对其降解酶基因进行克隆，为进一步研究其降解机制、构建具有更强降解能力的基因工程菌奠定基础。从久效磷生产企业曝气池的底层污泥中分离筛选到一株久效磷降解细菌，编号为M-1，该菌能以久效磷作为唯一碳、氮源但不能作为唯一磷源生长。经过对其形态特征、生理生化、16S rDNA序列以及DNA-DNA分子杂交分析，该菌株初步鉴定为Paracoccus versutus。M-1最适生长温度为30℃，最适生长初始pH为8.0，该菌对浓度为3％NaCl敏感，对庆大霉素、壮观霉素有拮抗作用，碱裂解法能够有效提取M-1质粒。M-1在好氧及厌氧条件下能够以久效磷作为唯一碳源生长，其对久效磷的最高耐受浓度为2500mg·L-1，最适生长浓度为300mg·L-1；M-1生长和降解久效磷的最适接种量为3％，温度为30℃，pH为7.5，装液量为100／250mL，NaCl浓度为0-0.05％。M-1能够降解其他有机磷化合物敌敌畏和磷胺，而对甲基1605没有降解效果；此外，M-1能够水解TpNPP（对硝基苯磷酸二钠盐）产生黄色pNP（对硝基苯酚），通过比色法测定反应体系对硝基苯酚的增加量对磷酸酯酶的定域表达进行研究，结果表明：膜结合酶的磷酸酯酶活性最低，分别为粗酶液、胞内酶以及菌悬液磷酸酯酶活性的11.85％、10.77％和23.15％，由此推测M-1所具有的磷酸酯酶为胞内酶。上述结果亦表明M-1主要是通过磷酸酯键的水解从而降解一系列的有机磷化合物。潮土和高沙土中的土著微生物能够促进土壤久效磷农药的降解，但久效磷在红壤中的微生物降解效果较差。接种降解菌Paracoccus versutus M-1于灭菌或新鲜潮土和高沙土中均能极显著提高久效磷农药的降解效率，但在红壤相同处理中却无降解效果。M-1在淹水状态和非淹水状态下均能迅速降解潮土中的久效磷残留，但久效磷在淹水状态下的降解效率显著高于非淹水状态。M-1在加富培养基中生长和降解敌稗的最佳接种量为3％，最适pH为7.5，最适温度为30℃。接种M-1 72h后，敌稗和丁草胺基本完全降解，乙草胺和丙草胺的降解效率分别为90.03％、78.76％；无机盐培养基中，敌稗、乙草胺、丙草胺、丁草胺的降解效率分别为48.55％、38.37％、51.73％和43.77％。通过HPLC检测发现：接种M-1于含有40mg·L-1敌稗的加富培养基中，随着培养基中敌稗含量的逐渐下降，发现在T=3.807处有一代谢底物峰的积累，此代谢物的保留时间与3，4-二氯苯胺一致；丁草胺降解过程中，保留时间为3.623处亦检测到一个未知化合物的积累，由此推测M-1主要通过酰胺键的断裂从而降解一系列的酰胺类化合物。以敌稗作为反应底物，通过HPLC测定反应体系3，4-二氯苯胺的增加量对降解酶的表达特性进行分析，结果表明：M-1的胞内酶降解敌稗的活性最高，为胞外酶活性的46.15倍，而周质酶未检测到酶活；敌稗作为诱导剂对M-1酰胺酶活性没有显著影响。M-1在潮土中20d对15mg／kg敌稗的降解效率为70.82％。以紫外扫描测定反应体系久效磷的减少量为依据，建立了久效磷降解酶的酶促反应体系。久效磷降解酶的定域试验表明该酶存在于M-1细胞内，组成表达。最适产酶碳、氮源分别为葡萄糖和硝酸铵。久效磷降解酶的最适反应温度为25℃，pH为8.0；久效磷降解酶在温度低于30℃，pH高于7.0稳定表达。粗酶液的Vmax为131.58μmol·min-1，Km为0.29μmol·mL-1，最大降解速率为682.12μmol·（min·mg）-1。M-1能够降解一系列的磷酸酯类化合物以及酰胺类化合物，且降解酶均位于M-1的胞内，组成表达。这表明Paracoccus versutus M-1降解久效磷的代谢途径可能与已报导的Arthrobacter atrocyaneus和Bacillus megaterium MCM B-423相同。通过吖啶橙法、SDS法、紫外线照射法、溴化乙锭法、高温法、冻融法以及连续传代法对M-1的质粒进行消除，结果表明高温法能够有效消除M-1的一个质粒，而对M-1的其它质粒没有消除效果。通过转座子插入突变法把自杀性质粒pSC123中的转座子插入到久效磷降解菌M-1的基因组中，以M-1能够利用久效磷作为唯一碳、氮源生长为筛选依据，经过初筛和复筛获得了4株完全丧失降解久效磷功能的插入突变子，编号为A12、G31、M25、X8。通过SEFA-PCR方法对插入位点两侧序列进行扩增，把扩增序列进行拼接，得到一条长度为6919bp的片断。此片断包含4个阅读框，G31和A12插入位点位于aac3和deh。Aac3的核酸序列与Xanthobacter autotrophicus的dh1B（the haloacid dehalogenase，脱卤基因）基因的同源性为88％，与Xanthobacter flavus的dh1A（the haloalkane dehalogenase gene，环烷烃脱卤基因）基因的同源性为88％，与Serratia marccscens N-乙酰胺转移酶基因（aac3-vb）的同源性为89％；氨基酸同源性分析表明deh具有功能蛋白信息，其与Bacillus sp.NRRL B-14911中短链脱氢酶具有48％的同源性，与Pseudomonas aeruginosa UCBPP-PA14中短链乙醇脱氢酶具有44％的同源性。通过互补表达策略，将带有外源片段的广宿主质粒MCS-5874转入突变菌株A12中，降解功能得到恢复，表明该片段可能为久效磷降解相关基因。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 符号与缩略语说明
• 文献综述
• 第一章 土壤农药污染及其生物修复
• 1.土壤农药污染现状
• 2 有机农药在土壤中的环境行为与降解机理
• 2.1 扩散作用
• 2.2 土壤吸附作用
• 2.3 挥发作用
• 2.4 水解作用
• 2.5 环境光化学行为
• 2.6 生物降解
• 3 农药对生物的影响
• 4 生物修复
• 4.1 生物修复的定义和分类
• 4.1.1 原位生物修复
• 4.1.2 异位生物修复
• 4.2 外源微生物引入的条件与原则
• 4.3 微生物修复的作用机制
• 4.3.1 矿化作用
• 4.3.2 共代谢作用
• 4.3.3 间接作用
• 4.3.4 参与微生物降解作用的生物化学过程
• 5 微生物修复的影响因素
• 5.1 物理化学因素
• 5.2 生物化学因素
• 6 生物修复过程的生态毒理诊断
• 7 久效磷的生物降解
• 7.1 生物转化
• 7.2 微生物降解
• 7.3 久效磷的降解途径
• 7.4 久效磷降解酶
• 参考文献
• 第二章 降解基因克隆方法概述
• 1.保守基因的克隆
• 1.1 引物扩增法
• 1.2 探针克隆法
• 2.新基因的克隆方法
• 2.1 功能克隆
• 2.1.1 鸟枪法
• 2.1.2 从蛋白质出发克隆
• 2.2 定位克隆
• 2.2.1 降解性质粒
• 2.2.2 转座子标签法
• 2.2.3 互补文库
• 2.2.4 随机引物克隆法
• 2.3 宏基因组
• 2.3.1 基于基因序列信息的筛选
• 2.3.2 基于功能表达的筛选
• 参考文献
• 实验部分
• 第一章 久效磷降解菌M-1的分离、筛选与鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.1.1 培养基
• 1.1.2 供试农药及试剂
• 1.1.3 供试菌株
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 菌株的富集和分离
• 1.2.2 生理生化反应
• 1.2.3 降解菌株总DNA的提取
• 1.2.4 降解菌株16S rDNA的PCR扩增
• 1.2.5 PCR产物的T/A克隆
• 1.2.6 高效感受态细胞的制备和转化
• 1.2.7 质粒DNA的小量提取
• 1.2.8 16S rDNA序列测定
• 1.2.9 系统发育分析
• 1.2.10 DNA-DNA同源性测定
• 1.2.10.1 DNA样品的剪切
• 1.2.10.2 DNA-DNA同源性测定
• 1.2.11 菌体生长量的测定
• 1.2.12 久效磷含量的检测
• 2 结果与分析
• 2.1 样品的富集培养及菌种分离纯化
• 2.2 M-1的菌落形态及生理生化特征
• 2.3 M-1系统发育分析
• 2.4 DNA-DNA同源性分析
• 2.5 环境条件对M-1生长的影响
• 2.5.1 温度对M-1生长的影响
• 2.5.2 pH对M-1生长的影响
• 2.5.3 NaCl浓度对M-1生长的影响
• 2.5.4 M-1对抗生素的耐受性
• 2.6 M-1质粒提取
• 3 结论
• 参考文献
• 第二章 久效磷降解菌株M-1降解特性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 供试菌株
• 1.2 培养基与试剂
• 1.3 菌株的培养及菌悬液的制备
• 1.4 培养条件对菌株生长和久效磷降解的影响
• 1.4.1 久效磷浓度对M-1生长的影响
• 1.4.2 环境因素对M-1生长和久效磷降解的影响
• 1.5 M-1对久效磷的降解试验
• 1.6 降解谱试验
• 1.7 磷酸酯酶的检测及测定
• 1.8 分析方法
• 2.结果与分析
• 2.1 久效磷浓度对M-1生长的影响
• 2.2 环境因素对M-1生长以及久效磷降解的影响
• 2.3 M-1对久效磷的降解
• 2.4 M-1对其他有机磷农药的降解
• 2.5 M-1磷酸酯酶活性的检测
• 3 讨论
• 本章小节
• 参考文献
• 第三章 久效磷污染土壤的生物修复研究
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种、培养基与试剂
• 1.2 菌株的培养及菌悬液的制备
• 1.3 久效磷在不同土壤降解试验
• 1.4 土壤水分含量对久效磷降解的影响
• 1.5土壤久效磷的提取与测定
• 2 结果与分析
• 2.1 M-1对不同土壤类型久效磷农药污染的生物修复效果
• 2.2 土壤水分含量对久效磷降解的影响
• 3 结论与讨论
• 参考文献
• 第四章 Paracoccus versutus.M-1降解酰胺类除草剂特性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株
• 1.2 培养基
• 1.3 供试农药及试剂
• 1.4 菌株培养及菌悬液的制备
• 1.5 培养条件对菌株生长和敌稗降解的影响
• 1.6 M-1对酰胺类除草剂的降解试验
• 1.7 粗酶液的制备
• 1.8 酰胺类除草剂降解酶活力测定
• 1.9 敌稗在土壤中的降解试验
• 2.结果与分析
• 2.1 培养条件对M-1生长和敌稗降解的影响
• 2.2 M-1对酰胺类除草剂的降解
• 2.3 M-1降解酰胺类除草剂代谢途径分析
• 2.4 酰胺酶活性分析
• 2.5 敌稗在潮土中的降解
• 3 讨论
• 本章小结
• 参考文献
• 第五章 久效磷降解菌M-1酶学特性的初步研究
• 1 材料与方法
• 1.1 供试菌株、培养基及试剂
• 1.2 菌株培养
• 1.3 粗酶液的制备
• 1.4 久效磷浓度的测定
• 1.5 碳、氮源对M-1生长和产酶的影响
• 1.6 pH、温度对久效磷降解酶活性的影响
• 1.7 pH、温度对久效磷降解酶稳定性的影响
• 2 结果与分析
• 2.1 M-1降解久效磷效果的测定
• 2.2 久效磷降解酶的定域实验
• 2.3 碳、氮源对M-1生长和产酶的影响
• 2.4 pH、温度对久效磷降解酶活性的影响
• 2.5 pH、温度对久效磷降解酶稳定性的影响
• 2.6 粗酶液的米式常数（Km）和最大反应速率（Vmax）
• 3 讨论
• 本章小结
• 参考文献
• 第六章 久效磷降解相关基因的克隆
• 1 材料与方法
• 1.1 培养基与试剂
• 1.2 菌株与质粒
• 1.3 质粒消除试验
• 1.4 菌体基因组DNA的提取
• 1.5 质粒DNA的小量提取
• 1.6 质粒DNA的大量提取
• 1.7 高效感受态细胞的制备和转化
• 1.8 转座子的导入
• 1.9 久效磷含量的检测
• 1.10 PCR法验证突变子基因组中的转座子片段
• 1.11 突变菌株的验证
• 1.12 久效磷降解基因的克隆
• 1.12.1 SEFA-PCR扩增原理与示意图
• 1.12.2 序列测定
• 1.12.3 目标片段的扩增
• 1.12.4 突变子降解功能的回复试验
• 2 结果与分析
• 2.1 M-1质粒消除
• 2.2 突变子的筛选与鉴定
• 2.3 突变子中插入片段的PCR验证
• 2.4 突变子中转座子侧翼序列的克隆
• 2.5 序列分析
• 2.6 功能验证
• 3 结论与讨论:
• 参考文献
• 全文总结
• 本论文研究的主要创新点
• 附录一 培养基及试剂配方
• 附录二 研究中获得的相关DNA序列
• 附录三 攻读博士学位期间发表的论文目录
• 致谢