AtNHX1基因和codA基因转化蓝浆果

论文摘要

本研究以蓝浆果品种伯克利和蓝丰为材料，采用农杆菌介导法和超声波辅助农杆菌介导法，将Na+／H+反向转运蛋白AtNHX1基因和胆碱氧化酶基因codA导入伯克利和蓝丰中，以获得耐盐碱新品系。研究结果如下：1．以两个北高丛蓝浆果和一个兔眼蓝浆果品种为试材，取单芽茎段为外植体，研究影响其离体繁殖的因素，筛选适宜的离体增殖和生根培养基。试验结果表明：兔眼蓝浆果品种粉蓝在改良1／2MS+ZT3mg·L-1培养基上初代培养后成活率可达100％，培养4w后，增殖系数为2.8。北高丛蓝浆果伯克利和蓝丰品种在添加了2-ip10mg·L-1和5mg·L-1改良1／2MS培养基上的成活率分别为90％和86.7％；伯克利和蓝丰在改良1／2MS+ZT5mg·L-1培养基上继代培养4w后，增殖系数最高，分别为6.2和4.8。2．以蓝浆果品种伯克利和蓝丰的叶片为农杆菌介导转化受体，通过对gus基因瞬时表达率和转化叶片再生情况的分析，研究它们的遗传转化体系的最佳实验参数。实验表明侵染5min，共培养4d，伯克利暗处理1w，蓝丰暗处理3w，添加AS80mg·L-1，Km20mg·L-1、Cef 250mg·L-1时gus基因瞬时表达率最高。3．本实验研究了不同的超声波处理时间结合超声波处理功率，确定了侵染前一定范围内的超声波处理对农杆菌介导蓝浆果转基因有促进作用。80W功率的超声波处理2s，超声波辅助农杆菌介导AtNHX1基因转化蓝丰，能获得交稿的gus基因瞬时表达率（55％）、较高的叶片不定芽再生率（23.33％）及较低的外植体褐化率（23.67％）；100W功率的超声波处理6s，超声波辅助农杆菌介导codA基因转化伯克利的效果最好，gus基因瞬时表达率为73.33％，外植体的褐化率为22％，叶片不定芽再生率为33.08％。4．本研究将AtNHX1基因和codA基因分别通过农杆菌介导法和SAAT法转化两个蓝浆果的品种伯克利和蓝丰，均获得了具有Km抗性株系。转化AtNBX1基因的伯克利和蓝丰的抗性率分别为6.66％和2.18％；转化codA基因的伯克利和蓝丰的抗性率分别为4.24％和3.18％。转codA基因的伯克利的GUS阳性率最高，为33.33％。用GUS组织化学染色、PCR扩增方法对蓝浆果的Km抗性植株进行了检测。结果表明，codA基因已经基本整合到其中5个株系基因组中；AtNHX1基因已经基本整合到其中2个株系基因组中。

论文目录

• 缩略语
• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1 植物耐盐机理的分子生物学研究进展
• 1.1 盐渍与植物生长之间的关系
• 1.1.1 盐渍对植物的伤害
• 1.1.2 植物耐盐途径
• 1.2 植物耐盐生理机制的研究
• 1.2.1 耐离子胁迫机制
• 1.2.2 耐渗透胁迫机制
• 1.2.3 胁迫信号系统与Ca离子调节
• 1.3 耐盐基因在植物中的遗传转化
• 1.4 AtNHX1基因与codA基因的遗传转化研究进展
• 1.4.1 AtNHX1基因的遗传转化
• +/H⁺逆向转运蛋白'>1.4.1.1 植物Na⁺/H⁺逆向转运蛋白
• 1.4.1.2 AtNBX1基因的研究
• 1.4.2 codA基因遗传转化的研究
• 1.4.2.1 甜菜碱
• 1.4.2.2 codA基因
• 2 果树遗传转化的研究进展
• 2.1 常见果树的转基因研究现状
• 2.2 果树基因转化方法
• 2.2.1 农杆菌介导法
• 2.2.2 基因枪法
• 2.2.3 DNA直接摄取法
• 2.2.4 超声波法
• 2.2.5 超声波辅助农杆菌遗传转化法
• 3 蓝浆果基因转化的研究进展
• 4 展望
• 第二章 三个蓝浆果品种的离体茎段培养
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 无菌苗的获得
• 1.2.2 增殖培养
• 1.2.3 生根培养
• 2 结果与分析
• 2.1 蓝浆果无菌苗的获得
• 2.2 适合蓝浆果品种的基本培养基的筛选
• 2.3 适合不同蓝浆果品种生长的激素的筛选
• 2.4 不同蓝浆果品种的增殖培养
• 2.5 蓝浆果无菌苗的生根及炼苗
• 3 讨论
• 第三章 伯克利和蓝丰蓝浆果的农杆菌介导的遗传转化体系的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 菌株和质粒
• 1.1.2.1 供试菌株、质粒及基因的特性
• 1.1.2.2 菌株的保存
• 1.1.3 培养基
• 1.1.3.1 蓝浆果基本培养基
• 1.1.3.2 细菌培养基与培养液
• 1.2 方法
• 1.2.1 农杆菌的培养、活化
• 1.2.2 农杆菌侵染时间的确定
• 1.2.3 共培养时间的确定
• 1.2.4 卡那霉素浓度的确定
• 1.2.5 头孢霉素浓度的确定
• 1.2.6 暗培养时间的确定
• 2.结果与分析
• 2.1 适宜农杆菌侵染时间的确定
• 2.2 适宜共培养时间的确定
• 2.3 适宜卡那霉素浓度的确定
• 2.4 头孢霉素浓度对叶片转化再生的影响
• 2.5 适宜暗培养时间的确定
• 3 讨论
• 第四章 超声波辅助农杆菌介导法获得转AtNHX1基因蓝丰和转codA基因伯克利株系
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 菌株和质粒
• 1.1.2.1 供试菌株、质粒及基因的特性
• 1.1.2.2 菌株的保存
• 1.1.3 培养基
• 1.1.3.1 蓝浆果基本培养基
• 1.1.3.2 细菌培养基与培养液
• 1.2 方法
• 1.2.1 农杆菌的培养、活化
• 1.2.2 超声波辅助农杆菌法对外植体的侵染与共培养
• 1.2.3 采用超声波辅助农杆菌介导法将AtNHX1基因转入蓝丰
• 1.2.3.1 不同超声波处理功率的影响
• 1.2.3.2 gus基因瞬时表达检测
• 1.2.4 采用超声波辅助农杆菌法将codA基因转入伯克利
• 1.2.4.1 不同超声波处理时间的影响
• 1.2.4.2 gus基因瞬时表达检测
• 2 结果与分析
• 2.1 不同超声波处理功率对转化蓝丰的影响
• 2.2 不同超声波处理时间对转化伯克利的影响
• 3 讨论
• 第五章 AtNHX1基因和codA基因转化蓝浆果转基因植株的获得与检测
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 菌株和质粒
• 1.1.2.1 供试菌株、质粒及基因的特性
• 1.1.2.2 菌株的保存
• 1.1.3 GUS染色液的配方（总10ml体系）
• 1.1.4 DNA提取所用溶液
• 1.2 方法
• 1.2.1 遗传转化
• 1.2.2 植物总DNA的提取
• 1.2.3 质粒DNA的提取
• 1.2.4 检测
• 1.2.4.1 GUS组织化学染色
• 1.2.4.2 PCR扩增检测
• 1.2.4.3 电泳检测
• 2 结果与分析
• 2.1 转AtNHX1基因和codA基因蓝浆果抗性苗的获得
• 2.2 转基因蓝浆果抗性植株的GUS染色
• 2.3 转基因蓝浆果PCR检测
• 3 讨论
• 全文结论
• 图版
• 致谢