马铃薯Y病毒和马铃薯卷叶病毒的实时荧光同步检测技术的研究

论文摘要

马铃薯是世界性高产作物,我国种植面积和产量都居世界第一位。马铃薯病毒病是马铃薯生产中的重要制约因素,严重影响其产量和质量,目前还没有“特效药”进行防治。实际生产中,脱毒种薯是防治马铃薯的主要措施,而这需要快捷、简便。特异灵敏的检测技术作为支撑。自PCR技术发明以来,RT-PCR已经成为病毒检测的一种普遍采用方法,该技术快速、特异、灵敏的特点,可以满足国内外现代植物检疫的要求。由于马铃薯病毒病常常为多种病毒复合感染,其中马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯卷叶病毒（PLRV）是危害最严重的病毒,并容易发生交叉感病。生产实践迫切需要有能够同时检测两种病毒的快速、灵敏检测技术。为此,本研究在设计、筛选对马铃薯Y病毒（PVY）和马铃薯卷叶病毒（PLRV）核酸特异性扩增的基础上,通过比较筛选快捷制样技术、优化检测程序和检测条件,建立二重荧光定量RT-PCR检测体系,用于PVY、PLRV的同步检测。该方法适用于马铃薯脱毒种薯质量检测和田间植株病害鉴定以及发病情况监控,具有实际应用价值。研究的主要内容及结果:1、通过比较改进CTAB法、试剂盒法、浸泡法、微滤柱离心法对提取RNA浓度和纯度的影响,确定微滤柱离心法作为病害检测的制样方法,该方法能有效地排除植物色素、蛋白质、多糖等物质对RT-PCR反应的干扰,制备适合于RT-PCR的马铃薯Y病毒、马铃薯卷叶病毒的RNA,减少RT-PCR的假阴性发生率。以RT-PCR获得的DNA片段经测序验证后以其为模板,通过体外转录获得大量、高质量RNA作为无害化阳性对照。2、选择两种病毒保守核苷酸序列区域分别设计各自的Taqman探针及其引物。标记多种发光基团和淬灭基团,分别建立了马铃薯Y病毒、马铃薯卷叶病毒的单重荧光定量RT-PCR检测方法,对影响PCR反应的一系列因素进行了优化,并建立了标准曲线,能够在病毒检测中进行绝对定量,最低能检测1500个拷贝模板数,在实际检测运用中取得很好的效果。3、在分别建立两种病毒实时荧光PCR检测方法的基础上,经过引物、探针以及检测条件的优化,建立了马铃薯Y病毒、马铃薯卷叶病毒双重RT-PCR检测体系。经确诊样品检验及田间实际样品检测验证,该体系检测特异性强,仅对PVY喝PLRV能检出,其他马铃薯病毒病及病原菌不能检出;灵敏度高,对PVY喝PLRV的检测敏感性均达到1500个模板拷贝数,比常规RT-PCR敏感性高100倍;抗干扰能力强,不受样品中两种病毒含量差异的影响,并且能够在病毒检测中进行相对定量,在实际检测运用中取得很好的效果。结论:建立了能够同时检测PVY和PLRV的二重荧光定量RT-PCR法。该方法快速、准确、灵敏、简便、安全,从样品的制备到获得检测结果,该体系仅用4h,符合实际检测要求。具有实际应用价值,适用于马铃薯病毒病害的快速检测。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 马铃薯病毒的概况
• 1.1.1 马铃薯Y 病毒和马铃薯A 病毒
• 1.1.2 马铃薯X 病毒
• 1.1.3 马铃薯卷叶病毒
• 1.1.4 马铃薯S 病毒和马铃薯M 病毒
• 1.2 马铃薯病毒的检测方法
• 1.2.1 指示植物法
• 1.2.2 电镜技术方法
• 1.2.3 以抗体为基础的免疫学检测方法
• 1.2.4 马铃薯病毒分子检测技术
• 1.3 荧光定量PCR 技术研究进展及其应用.
• 1.3.1 实时荧光定量PCR 原理
• 1.3.2 实时荧光定量PCR 的种类
• 1.3.3 定量方法
• 1.3.4 实时荧光定量PCR 方法的应用
• 1.3.5 多重荧光定量PCR
• 1.4 研究目的和意义
• 1.5 研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 主要试剂和实验仪器
• 2.2 样品总RNA 的提取
• 2.2.1 浸泡法
• 2.2.2 异硫氰酸胍法
• 2.2.3 改进CTAB 法
• 2.2.4 微滤柱离心法
• 2.2.5 试剂盒提取法
• 2.3 PVY、PLRV 阳性标准品CRNA 的制备
• 2.3.1 阳性质粒的提取
• 2.3.2 体外转录得到cRNA
• 2.3.3 标准品浓度的测定
• 2.4 单重荧光RT-PCR 检测PVY、PLRV 体系的建立
• 2.4.1 引物和TaqMan 探针的设计
• 2.4.2 实时荧光定量RT-PCR 反应
• 2.4.3 荧光定量RT-PCR 体系的优化
• 2.4.4 荧光定量RT-PCR 特异性检测
• 2.4.5 荧光定量RT-PCR 灵敏度检测及标准曲线的绘制
• 2.5 单重荧光RT-PCR 对组培样品的检测及扩增靶片段的克隆与测序
• 2.5.1 RT-PCR 产物的扩增与回收
• 2.5.2 大肠杆菌感受态的制备
• 2.5.3 靶片段与载体的体外连接
• 2.5.4 质粒的转化
• 2.5.5 阳性转化子的筛选与鉴定
• 2.5.6 PCR 扩增产物的测序
• 2.6 两重荧光定量RT-PCR 对PVY 和PLRV 的检测体系的建立
• 2.6.1 两重实时荧光定量RT-PCR 反应
• 2.6.2 实时荧光RT-PCR 检测体系优化
• 2.6.3 探针浓度组合选择
• 2.6.4 检测特异性验证
• 2.6.5 重复性验证及抗干扰性验证
• 2.6.6 两重荧光定量RT-PCR 对样品的检测
• 3 结果与分析
• 3.1 马铃薯叶片总RNA 的提取方法优化
• 3.2 阳性标准品制备
• 3.3 单重荧光RT-PCR 检测体系的建立
• 3.3.1 单重荧光定量 RT-PCR 体系的优化
• 3.3.2 单重荧光定量特异性检测
• 3.3.3 单重荧光定量灵敏性检测和标准曲线的绘制
• 3.4 RT-PCR 产物的克隆与测序
• 3.5 两重荧光定量RT-PCR 检测体系的建立
• 3.5.1 探针浓度组合选择
• 3.5.2 分别检测单重RT-PCR 和两重RT-PCR 重复性验证
• 3.5.3 与常规RT-PCR 检测方法的对比及对送检样品的检测
• 4 讨论
• 4.1 不同制样方法对检测结果的影响
• 4.2 引物探针检测性能的比较
• 4.3 RT-PCR 检测假阳性与假阴性的排除与降低
• 4.4 常规RT-PCR 与荧光定量RT-PCR 检测方法的比较
• 4.5 单重荧光定量RT-PCR 方法与多重荧光定量方法的比较.
• 5 结论与后续工作建议
• 5.1 结论
• 5.2 后续工作建议
• 致谢
• 参考文献
• 附录