乙醇发酵相关基因在芽孢杆菌中的表达及分析

论文摘要

20世纪70年代的石油危机及当今世界对能源需求的急剧增长,加快了人们开发燃油替代能源的步伐。作为传统的生物发酵产品和潜力巨大的燃料,乙醇已被公认为是最有发展前景的可再生清洁能源之一。木质纤维素是世界上最丰富的可再生资源。对木质纤维素利用的研究,特别是通过微生物将木质纤维素转化为乙醇是当前的研究热点之一,也是难点之一。本文以运动发酵单胞菌作为出发菌株,以质粒pMA5作为表达载体,通过PCR扩增得到乙醇发酵关键酶乙醇脱氢酶基因adh,进而构建重组质粒pMA5-adh并转化枯草芽孢杆菌,构建表达乙醇脱氢酶基因的芽孢杆菌工程菌株。通过测定乙醇脱氢酶酶活及其影响因素研究乙醇脱氢酶基因adh在芽孢杆菌中的表达及酶学特性。克隆得到的运动发酵单胞菌adh开放阅读框全长1152 bp,编码383个氨基酸,推测的蛋白质分子量为40.16 kDa,蛋白的理论等电点为5.61。利用化学感受态法成功的将乙醇脱氢酶基因adh转入枯草芽孢杆菌中,得到的转化子能够稳定遗传。通过对转化子乙醇脱氢酶的酶学特性研究发现,枯草芽孢杆菌转化子的产酶高峰出现在18h,重组乙醇脱氢酶酶促反应的最适pH为10.0,最适温度为47℃, K+对ADH有促进作用,酶活与标准状态下比较提高了8.8%;二价金属离子对ADH有不同程度的抑制作用,Cu2+的抑制作用较强,酶活被抑制了76.8%,Zn2+和Co2+也有一定程度的抑制作用,均被抑制了27.5%,Mg2+对ADH几乎没有影响。本文通过对运动发酵单胞菌乙醇脱氢酶基因在纤维素降解受体菌枯草芽孢杆菌中表达的研究,为利用生物质资源生产燃料乙醇相关方面的研究奠定了理论基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 研究背景
• 1.2 国内外研究现状
• 1.2.1 运动发酵单胞菌
• 1.2.2 芽孢杆菌
• 1.2.3 芽孢杆菌的转化方法概述
• 1.2.4 细菌的乙醇发酵
• 1.2.5 酒精生产菌类别
• 1.2.6 乙醇脱氢酶的国内外研究现状
• 1.3 课题来源及主要研究内容
• 1.3.1 课题来源
• 1.3.2 主要研究内容
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 酶与试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.1.5 常用试剂和缓冲液
• 2.1.6 引物设计及相关软件
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 乙醇脱氢酶基因的PCR扩增
• 2.2.2 重组质粒的构建及验证
• 2.2.3 重组质粒转化芽孢杆菌
• 2.2.4 质粒稳定性
• 2.2.5 重组乙醇脱氢酶的酶学特性的研究
• 第3章 乙醇脱氢酶基因的获得及重组质粒的构建
• 3.1 乙醇脱氢酶基因的PCR扩增
• 3.1.1 运动发酵单胞菌基因组的提取
• 3.1.2 乙醇脱氢酶基因的PCR扩增
• 3.2 连接克隆载体、测序结果及分析
• 3.3 重组质粒pMA5-adh的构建
• 3.3.1 枯草芽孢杆菌B.168 质粒pMA5 的提取
• 3.3.2 adh基因和pMA5 的双酶切及连接
• 3.3.3 重组质粒pMA5-adh的验证
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 第4章 芽孢杆菌的转化及转化子酶活特性分析
• 4.1 枯草芽孢杆菌的转化
• 4.1.1 枯草芽孢杆菌对卡那霉素的敏感性分析
• 4.1.2 枯草芽孢杆菌生长曲线的测定
• 4.1.3 枯草芽孢杆菌的转化方法
• 4.2 质粒稳定性
• 4.3 乙醇脱氢酶酶学特性的研究
• 4.3.1 培养时间对转化子产乙醇脱氢酶的影响
• 4.3.2 重组乙醇脱氢酶的最适作用pH
• 4.3.3 重组乙醇脱氢酶的最适作用温度
• 4.3.4 金属离子对重组乙醇脱氢酶的影响
• 4.4 讨论
• 4.4.1 质粒的稳定性
• 4.4.2 转化方法
• 4.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士期间发表的论文
• 致谢