烟草铁蛋白基因表达增强与抑制的效应

论文摘要

铁蛋白是一种大的蛋白质外壳,能以一种安全、无毒的形式储存多达4500个铁原子,广泛存在于动植物中。本研究以烟草为受体,以两个烟草铁蛋白基因（NtFer1 andNtFer2,GenBank accession number:AY083924,AY141105）为目标基因,构建铁蛋白表达增强与表达抑制的植物表达载体,用农杆菌介导法转化烟草（SR-1 strain）,研究铁蛋白基因表达增强与沉默的效应,从而研究铁蛋白基因的功能,为其在植物基因工程育种中的应用提供依据。用RT-PCR方法从烟草（Nicotiana tabacum）中克隆出两个铁蛋白基因,将其亚克隆到植物表达载体pBI121中,构建两个铁蛋白基因的正义和反义表达载体。利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导法将正义反义铁蛋白基因导入烟草基因组,培育转基因烟草。对转基因烟草T1代植株的卡那霉素抗性分析表明,多数转基因植株后代表现为3:1的分离比例,少数转基因植株的抗性分离表现为15:1或不符合孟德尔遗传分离比例。说明整合到烟草基因组内的外源基因多为单拷贝基因,少数为多拷贝基因。对T1代植株进行PCR检测证明:两个铁蛋白基因的正义反义序列已经整合到烟草基因组中,并且可以通过有性生殖传递给后代。Northern杂交分析表明正义表达铁蛋白基因不同程度上提高了铁蛋白基因mRNA的含量,而反义表达铁蛋白基因在不同程度上降低了铁蛋白基因mRNA的含量。分析四个转基因群体T1代在高浓度铁离子和低浓度铁离子胁迫条件下的株高、鲜重、叶绿素含量、相对总铁含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化物酶（POD）活性和净光合速率等生长性状和生理特性的变化情况表明:过量表达铁蛋白基因从总体上提高了植株在高铁浓度和低铁浓度下的表现;而反义表达铁蛋白基因则降低了植株对高铁浓度和低铁浓度的耐受能力。采用细菌双杂交分析,检测到烟草体内两个铁蛋白之间存在强相互作用,推测这可能是导致两个铁蛋白基因同时被上调节表达和下调表达的原因之一。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 Research Proceeding of Ferritin
• 1.1.1 Main physiological roles of ferritin in plant
• 1.1.2 Introduction to ferritin
• 1.1.3 Some feasible application of ferritin
• 1.2 基因沉默发生的原因
• 1.2.1 位置效应的基因沉默
• 1.2.2 转录水平的基因沉默
• 1.2.3 转录后基因沉默
• 1.3 转录后基因沉默现象的发现及定义
• 1.4 转录后基因沉默的作用机制
• 1.5 PTGS诱导技术
• 1.6 RNAi技术的应用
• 1.6.1 高通量的基因功能研究
• 1.6.2 基因治疗
• 1.6.3 基因表达调控
• 1.7 PTGS技术在作物遗传改良中的应用
• 1.7.1 培育抗病毒作物
• 1.7.2 作物品质遗传改良
• 1.8 展望
• 1.9 研究目的和意义
• 2 NtFer1,NtFer2Plant Expression Vector Construction and Tobacco Transformation
• 2.1 Materials
• 2.1.1 Bacterial strains and plasmids
• 2.1.2 Plant materials
• 2.1.3 Media
• 2.1.4 Enzymes and Kits
• 2.1.5 Primer sequence
• 2.2 Experimental procedures
• 2.2.1 NtFer1,NtFer2 cloning and sequecing
• 2.2.2 Subcloning of NtFer1 and NtFer2
• 2.2.3 Electroporation of construct into agrobactcrium strain EHA105
• 2.2.4 表达正义、反义铁蛋白基因烟草的遗传转化
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 烟草总RNA质量分析
• 2.3.2 RT-PCR获得NtFer1,NtFer2基因
• 2.3.3 重组质粒PCR检测
• 2.3.4 目的基因片段双酶切
• 2.3.5 植物表达载体pBI121双酶切
• 2.3.6 重组植物表达载体PCR检测
• 2.3.7 重组表达载体双酶切检测
• 2.3.8 重组农杆菌PCR检测
• 2.3.9 转铁蛋白基因烟草的获得
• 2.4 讨论与小结
• 2.4.1 反义RNA技术的有效实施
• 2.4.2 烟草叶片处理对转化后再生的影响
• 2.4.3 转化过程对转化的影响
• 2.4.4 选择培养方法对转化效率的影响
• 3 Molecular Detection
• 3.1 Materials
• 3.1.1 Plant materials
• 3.1.2 Reagents and solutions
• 3.1.3 Enzymes and kits
• 3.1.4 Primers
• 3.2 Experimentalprocedures
• 3.2.1 Genetic analysis of T1 generation
• 3.2.2 转化烟草的PCR检测
• 3.2.3 Probe synthosis for Northern blot
• 3.2.4 Northern Blot
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 烟草T0代PCR检测
• 3.3.2 T1代转基因烟草的遗传分析
• 3.3.3 T1代烟草的分子检测
• 3.4 讨论与小结
• 3.4.1 DNA水平上的分析
• 3.4.2 RNA水平上的分析
• 4 Functional verification of NtFer1 and NtFer2
• 4.1 Materials
• 4.1.1 Plant materials
• 4.1.2 Media
• 4.1.3 Instruments
• 4.2 Experimental procedures
• 4.2.1 T1 generation plant stress treatment
• 4.2.2 Physiological traits determination
• 4.3 Results and Analysis
• 4.3.1 Plant height comparison
• 4.3.2 Plant fresh weight comparison
• 4.3.3 Chlorophyll content comparison
• 4.3.4 Relative total iron content comparison
• 4.3.5 SOD activity comparison
• 4.3.6 POD activity comparison
• 4.3.7 Comparison of net photosynthetic rate of transgenic plants
• 4.4 Discussion
• 4.4.1 铁蛋白基因功能的分析
• 4.4.2 转铁蛋白基因烟草不同铁浓度下生理生化的反应
• 5 NtFer1和NtFer2的相互作用
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 将NtFer1和NtFer2克隆到pBT和pTRG载体中
• 5.1.2 共转化
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 蛋白互作涂板分析
• 5.2.2 阳性克隆的链霉素抗性筛选
• 5.3 讨论
• 5.3.1 细菌双杂交的优点
• 5.3.2 对铁蛋白互作的解释
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢