法夫酵母新科斯糖的鉴定及相应产糖酶的研究

论文摘要

本论文以法夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous）为出发菌株,以本研究室发明专利《一种低聚糖-新科斯糖的发酵法生产方法》[公开号CN1873016A]的生产技术,发酵生产低聚糖,对该低聚糖的结构进行分析,并对发酵过程中的酶初步分离,研究其性质。测定发酵液的酶活,其具有一定的糖苷酶活力。对发酵液中糖类物质高效液相色谱分析表明,发酵液中可能存在新科斯糖。以蔗糖为底物,发酵液为酶源进行酶解反应（温度18℃,pH6.5）,酶解产物的高效液相色谱分析表明其中蔗糖含量降低,新科斯糖的含量增加,并同时伴随有葡萄糖和果糖的产生,初步说明发酵液中的产糖酶具有果糖基转移作用。采用高效液相NH2制备柱对发酵产物进行纯化制备,收集其中的一种主要的低聚糖,对其进行质谱和13C核磁共振分析,解析两谱图表明,该低聚糖的分子量为504Da,其结构为β-D-呋喃果糖（2→6）-α-D-吡喃葡萄糖（2→1）-β-D-呋喃果糖,即为新科斯糖。采用硫酸铵沉淀,AKTA蛋白纯化层析系统（DEAE Spherose FF层析柱）层析对发酵液中的酶进行初步分离,研究酶学性质。结果表明,该酶分子量约为70542Da,酶解反应的最适温度范围为1830℃,且该温度范围内酶活稳定,随着温度的升高,酶活力迅速下降,60℃完全失活。其最适pH为6.5,pH 5-6.5范围内,酶活力稳定。研究了部分化学物质对酶活力的影响,其中K+（2mmol/L）对酶活力几乎没有影响,甚至具有激活作用;Ca2+和Mg2+（2 mmol/L）对酶活力影响不大,Zn2+和Al3+（2 mmol/L）对酶活力有抑制作用。2 mmol/L的十二烷基磺酸钠（SDS）和脲对酶活力没有影响,但SDS的浓度增加到10 mmol/L时,对酶活力有较强的抑制作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 低聚果糖概述
• 1.1.1 低聚果糖的结构
• 1.1.2 低聚果糖的生理特性
• 1.1.3 低聚果糖的生产
• 1.1.4 低聚果糖的应用
• 1.2 合成低聚果糖相关酶的研究
• 1.2.1 酶的名称
• 1.2.2 酶的来源、反应机理及酶学性质
• 1.3 本课题的研究意义
• 1.4 本课题的研究内容
• 第二章 法夫酵母新科斯糖及其相关酶的初步分析
• 2.1 引言
• 2.2 主要材料
• 2.2.1 仪器与试剂
• 2.2.2 菌种
• 2.3 培养基
• 2.4 发酵培养方法
• 2.4.1 种子培养方法
• 2.4.2 摇瓶培养方法
• 2.5 发酵液制备
• 2.6 酶活测定方法
• 2.7 发酵液中新科斯糖和酶解产物的分析方法
• 2.8 结果与讨论
• 2.8.1 发酵液中新科斯糖的分析
• 2.8.2 酶的分析
• 2.9 结论
• 第三章 法夫酵母所产新科斯糖的结构鉴定
• 3.1 引言
• 3.2 主要材料
• 3.2.1 仪器与试剂
• 3.2.2 菌种
• 3.3 培养基
• 3.4 发酵培养方法
• 3.5 多糖混合液的制备
• 3.6 低聚糖的纯化
• 3.7 质谱分析条件
• 3.8 核磁共振分析条件
• 3.9 结果与分析
• 3.9.1 低聚糖的纯化
• 3.9.2 质谱图谱分析
• 13C 核磁共振图谱分析'>3.9.3¹³C 核磁共振图谱分析
• 3.10 结论
• 第四章 法夫酵母所产新科斯糖酶的初步分离及酶学性质
• 4.1 引言
• 4.2 主要仪器与试剂
• 4.2.1 主要仪器
• 4.2.2 试剂
• 4.2.3 发酵液
• 4.3 酶活测定方法
• 4.4 蛋白质含量测定
• 4.5 酶的初步纯化
• 4.5.1 硫酸铵沉淀
• 4.5.2 DEAE-Sepharose FF 离子交换层析
• 4.6 活性聚丙烯酰胺电泳
• 4.6.1 活性电泳工作液的配制
• 4.6.2 活性电泳的制备过程
• 4.6.3 活性电泳谱带的制备
• 4.7 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 4.7.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的制备
• 4.7.2 标准蛋白的准备
• 4.7.3 SDS-PAGE 法测定酶分子量
• 4.8 酶学性质研究方法
• 4.8.1 酶的最适温度及热稳定性
• 4.8.2 酶的最适pH 及酸碱稳定性
• 4.8.3 金属离子和其他化学物质对酶活力的影响
• 4.9 结果与讨论
• 4.9.1 盐析
• 4.9.2 DEAE-Sepharose FF 离子交换层析
• 4.9.3 活性聚丙烯酰胺电泳
• 4.9.4 酶学性质
• 4.10 结论
• 结论与展望
• 结论
• 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间成果