布鲁氏菌双组份调控系统外磷酸化的初步研究

论文摘要

双组分调控系统是由具备跨膜结构域的组氨酸激酶和胞内具备转录因子活性的反应调节蛋白两部分组成,是广泛参与细菌生理调节的信号转导系统。细菌利用组氨酸激酶膜外的感知结构域感知外界环境变化,然后将信号传递给胞内的反应调节蛋白,反应调节蛋白行使转录因子的活性调节相关基因的表达来适应环境。病原菌在感染宿主周期过程中应对不同的环境变化也会利用双组分调控系统进行自我的生理调整,因此双组分调控系统是病原菌致病不可或缺的一部分。虽然对于布鲁氏菌毒力因子与双组分调控系统的研究有所进展,但对布鲁氏菌双组分调控系统的基础性研究却很少。因此本研究从National center for biotechnology Information （NCBI）里查找了BMEI0374、BvrS、TceS、TcfS和CenK5个布鲁氏菌组氨酸激酶和18个反应调节蛋白的基因,在大肠杆菌里表达后纯化,对其自身磷酸化的功能做了初步的研究。为了获得可溶且具有活性的组氨酸激酶,通过生物信息学分析只表达组氨酸激酶的胞内结构域。根据胞内结构域基因的序列设计引物,经PCR从布鲁氏菌16M菌株基因组中扩增得到了胞内结构域的基因序列,将基因片段克隆到pET-28a中,构建重组表达质粒pET28a-HK.转化大肠杆BL21（DE3）,经IPTG诱导,结果只有BMEI0374、BvrS、TceS和TcfS四个蛋白实现了可溶表达。通过对组氨酸激酶体外自身磷酸化的反应条件做了一些初步的研究,发现只有BvrS能发生自身磷酸化。这些工作为布鲁氏菌双组分调控系统体外磷酸传递图谱的建立及激酶作为病原菌抑制剂的筛选奠定良好的基础。用同样方法表达纯化全长RR,其中RR4不表达,RR10形成包涵体没有得到足够多的可溶蛋白,其余的16个RR蛋白均得到足够多的可溶性蛋白。经体外乙酰磷酸自身磷酸化研究后,发现RR1、RR2、RR3、RR5、RR6、RR7、RR8、RR11、RR13、RR14、RR15和RR16能利用乙酰磷酸作为磷酸供体发生磷酸化,而RR9、RR12、RR17和RR18用乙酰磷酸处理后不能发生磷酸化。RR的自身磷酸化的研究为在没有辅助蛋白HK的情况下筛选RR的调控序列建立基因调控网络打下了良好的基础。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 1 前言
• 1.1 布鲁氏菌病（简称布病）发病机制
• 1.2 布鲁氏菌毒力因子研究进展
• 1.2.1 群体感应系统
• 1.2.2 VirB操纵子编码的Ⅳ型分泌系统
• 1.2.3 鞭毛系统
• 1.2.4 压力调节系统
• 1.3 细菌双组分调控系统研究概述
• 1.3.1 双组份调控系统概述
• 1.3.2 布鲁氏菌双组份调控系统的研究进展
• 2 研究的目的与意义
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.2.1 布鲁氏菌双组份调控系统组氨酸激酶和反应调节蛋白表达载体的构建
• 3.2.2 布鲁氏菌组氨酸激酶和反应调节蛋白的表达与纯化
• 3.2.3 布鲁氏菌组氨酸激酶和反应调节蛋白的体外自身磷酸化
• 4 结果与分析
• 4.1 布鲁氏菌双组份调控系统组氨酸激酶和反应调节蛋白表达载体的构建
• 4.1.1 布鲁氏菌组氨酸激酶胞内结构域基因序列的PCR扩增
• 4.1.2 布鲁氏菌反应调节蛋白基因序列的PCR扩增
• 4.1.3 布鲁氏菌组氨酸激酶表达载体的双酶切验证
• 4.1.4 布鲁氏菌反应调节蛋白表达载体的双酶切验证
• 4.1.5 测序
• 4.2 HK和RR重组质粒在大肠杆菌中的表达
• 4.3 HK和RR蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化
• 4.4 组氨酸激酶和反应调节蛋白体外磷酸化的研究
• 4.4.1 组氨酸激酶体外磷酸化
• 4.4.2 反应调节蛋白体外磷酸化
• 5 讨论
• 6 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢