油桐悬浮细胞系的建立及FLC同源基因的分离克隆

论文摘要

油桐是我国特有经济林木,栽培历史悠久,品种多,分布广。以其种子为原料榨制而成的桐油是重要的工业用油,经济价值高。同时,油桐（三年桐）具有独特的生物学特性,具有成为经济林模式植物的潜力。本文以具有独特早花性状的对年桐为研究对象,通过愈伤组织诱导途径,初步建立了悬浮细胞体系,为进一步的油桐细胞生物学研究和细胞遗传操作提供了良好的实验系统和理论依据。同时进行了油桐成花抑制基因FLC同源基因分离克隆的研究,是建立油桐成花基因调控机理实验体系的一部分,可以从分子水平上为研究油桐成花机理提供一条新途径。本论文主要研究结果如下：1、以油桐叶片为材料进行愈伤组织的诱导试验。通过比较不同外植体、培养基以及生长调节剂的种类和用量的愈伤组织诱导效果,筛选出植物生长调节剂最佳组合及配比,结果表明,2/3 MS+KT 0.5（mg/L）+2,4-D 0.3（mg/L）为最佳培养基配方,可以快速诱导出疏松程度较好、脱分化程度较高的愈伤组织,为下一步建立悬浮细胞系奠定了基础。2、以愈伤组织,建立了油桐起始悬浮细胞系。通过观察细胞不同起始浓度对油桐悬浮细胞生长状况的影响,发现浓度过低,细胞生长速率降低,分化能力较弱,细胞很难增殖；浓度过高,则生长周期缩短,后期细胞生活率低。从保持油桐悬浮细胞系稳定性的角度看,适宜的起始接种浓度为1.5×104-1.0×105个/mL。3、观测了油桐悬浮细胞系的生长规律。以细胞生长量（鲜重）为指标,绘制了油桐悬浮细胞的生长曲线,建立了理论生长模型。结果表明,油桐悬浮细胞系的生长动态可分为延迟期、对数生长期、减慢生长期以及衰亡期,基本呈“s”形曲线。4、初步建立了油桐悬浮细胞系继代培养条件：2/3 MS液体培养基,2,4-D 0.3 mg/L,KT 0.5 mg/L,3%蔗糖,pH 5.8,于25℃散射光或黑暗的培养室,回旋式振荡培养,转速为110 rpm,悬浮培养初期每隔9d继代换液1次。27 d后,转人新鲜培养基中,每隔6d继代换液1次。5、以对年桐为材料,对提取的基因组总DNA及花芽总RNA,分别设计引物,以期利用PCR扩增出油桐FLC基因的部分片段。但是测序结果经网上Blast比对相似度太低,不能证明是FLC基因的部分序列。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 目录
• 1 绪言
• 1.1 油桐概述
• 1.2 植物组织培养技术
• 1.2.1 植物组织培养的类型
• 1.2.2 植物组织培养的影响因素
• 1.2.3 植物组织培养的应用
• 1.2.4 大戟科植物组织培养概况
• 1.3 花发育调控基因的研究进展
• 1.3.1 花分生组织特异表达基因
• 1.3.2 抑制成花的相关基因FLC
• 1.4 研究的目的意义及研究内容
• 1.4.1 研究的目的意义
• 1.4.2 研究内容
• 2 油桐细胞悬浮培养
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 主要试剂及仪器
• 2.1.3 培养基的配制和灭菌
• 2.1.4 材料消毒处理
• 2.1.5 外植体培养方法
• 2.1.6 继代培养
• 2.1.7 油桐细胞悬浮培养
• 2.1.8 油桐细胞悬浮培养生长特性的测定
• 2.1.9 悬浮细胞生长模型的建立
• 2.2 实验结果与分析
• 2.2.1 正交实验结果
• 2.2.2 油桐细胞悬浮细胞系的生长状况
• 2.2.3 油桐细胞悬浮培养生长曲线
• 2.2.4 悬浮细胞的理论生长模型
• 2.3 小结与讨论
• 3 油桐成花抑制基因FLC的克隆
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 实验结果与分析
• 3.2.1 DNA浓度及纯度测定
• 3.2.2 电泳检测提取的基因组DNA及RNA
• 3.2.3 PCR扩增结果
• 3.2.4 克隆片段测序结果及序列分析
• 3.3 小结与讨论
• 4 结论与创新
• 4.1 结论
• 4.2 创新点
• 参考文献
• 附录A 基本培养基配方
• 附录B 测序图
• 附录C 实验药品
• 附录D 硕士研究生阶段发表的学术论
• 致谢