玉米检疫性种传细菌免疫学及基因芯片检测方法的研究

论文摘要

玉米细菌性枯萎病(Bacterial Wilt of Corn or Stewart’s Wilt, Pantoea stwartii)和玉米内州萎蔫病(Goss’s bacterial wilt and blight of maize, Clavibacter. subsp.nebraskensis)是玉米生产上的两种重要病害,在北美州国家或地区有大面积发生的报道。我国尚未有两种病害发生的报道,已被列入我国进境植物检疫性有害生物名录中。因此,建立一套灵敏、高效的检验检疫方法显得尤为重要。两种病原菌的常用检测方法有分离培养、免疫学、PCR检测方法。目前还没有玉米内州萎蔫病菌单克隆抗体在免疫学检测方面应用的报道,。基因芯片检测方法是一种世界上最先进便携式生物化学分析器的核心技术,与上述三种检测方法相比,检测灵敏度高,且可实现高通量、并行性的检测目的。因此,本论文在实验室现有玉米内州萎蔫病菌单克隆抗体的基础上,建立了双单抗夹心ELISA检测方法,填补了目前国内外无该病菌单抗检测方法的空白,并为后期检测试剂盒及试纸条的研制奠定了基础。对两种玉米检疫性细菌及其相关病菌进行基因芯片检测研究,建立了高通量、并行性的基因芯片检测方法。结果如下:1对筛选到的玉米内州萎蔫病菌单克隆抗体进行亚类、效价等指标的测定,并对ELISA检测中抗原、抗体测试浓度进行了筛选。2建立了双单抗夹心ELISA检测方法,检测灵敏度可达1.0×108 CFU/L,并进行了玉米种子样品添加测试。实验结果表明,该检测方法重复性好且稳定性高。3设计筛选了针对两种病原细菌的特异性引物及探针,以及与玉米内州萎蔫病菌属同一亚种的番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis)、苜蓿细菌性萎蔫病菌(Clavibacter michiganensis subsp.insidiosus)的通用引物及相应的探针,建立了四种病原菌的多重PCR扩增方法,可以有效扩增出各菌株的目的基因片段。4制备了针对四种目标病原菌的基因芯片,并对各测试条件进行了筛选,确立了各阶段的最适反应条件。5建立了四种病原菌的基因芯片检测方法,该方法实现了多种病原菌的同时检测,其检测灵敏度高、特异性好,结果可直接通过肉眼观测,且在样品检测过程中受基质影响很小,检测效率高。本研究建立的双单抗夹心检测方法和基因芯片检测方法,在一定程度上均可满足对口岸进境玉米中细菌性枯萎病菌和内州萎蔫病菌的检测要求。相比较而言,基因芯片检测方法的灵敏度和检测效率比ELISA检测方法略高,但由于基因芯片检测成本交较高,在一定程度上,可应用ELISA检测方法进行初检,以降低检测成本,对阳性样品或可疑结果样品进行基因芯片复检,两种检测方法配合使用,实现准确、高效、经济的检测目的。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 发生及危害
• 1.1.1 玉米细菌性枯萎病
• 1.1.2 玉米内州萎蔫病
• 1.2 病原形态及生化性状
• 1.2.1 玉米细菌性枯萎病菌
• 1.2.2 玉米内州萎蔫病菌
• 1.3 主要检测及鉴定方法
• 1.3.1 分离培养检测方法
• 1.3.2 免疫学检测方法
• 1.3.3 分子生物学检测方法
• 1.3.4 基因芯片技术
• 1.4 本研究的目的及意义
• 1.4.1 建立玉米内州萎蔫病菌的免疫学检测方法
• 1.4.2 建立玉米检疫性种传细菌病害及相关病菌基因芯片检测方法
• 第二章 玉米内州萎蔫病菌DAS-ELISA 检测方法的建立
• 2.1 实验材料与试剂
• 2.1.1 菌株与试剂
• 2.1.2 玉米种子材料
• 2.1.3 仪器与设备
• 2.1.4 主要溶液
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 细菌悬浮液的制备
• 2.2.2 抗体纯化及亚类鉴定
• 2.2.3 抗体碱性磷酸酶（Ap）标记
• 2.2.4 ELISA 条件优化及检测方法的建立
• 2.2.5 抗体效价的测定
• 2.2.6 抗体特异性及检测灵敏度的测定
• 2.2.7 样品测试
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 单克隆抗体蛋白浓度测定
• 2.3.2 单克隆抗体亚类鉴定及效价的测定
• 2.3.3 抗体的特异性及灵敏度测定
• 2.3.4 样品测定
• 2.4 讨论
• 2.4.1 间接ELISA 检测方法中包被条件的探讨
• 2.4.2 影响抗原抗体反应的因素
• 2.4.3 两种检测方法灵敏度对比
• 2.4.4 DSA-ELISA 检测方法中样品添加方法的探讨
• 2.5 本章小结
• 2.5.1 两株单克隆抗体亚类、效价等指标的测定
• 2.5.2 两种ELISA 检测方法的建立
• 2.5.3 DAS-ELISA 检测方法的特异性
• 2.5.4 两种ELISA 检测方法的灵敏度
• 2.5.5 两种检测方法的样品添加检测
• 第三章 玉米检疫性种传细菌及相关病菌基因芯片检测方法的建立
• 3.1 材料与试剂
• 3.1.1 供试菌株
• 3.1.2 仪器与设备
• 3.1.3 试剂
• 3.1.4 主要溶液
• 3.2 方法
• 3.2.1 菌株增菌培养及计数
• 3.2.2 细菌基因组DNA 的提取
• 3.2.3 引物及探针的设计
• 3.2.4 PCR 扩增及条件优化
• 3.2.5 PCR 检测特异性及灵敏度实验
• 3.2.6 基因芯片上反应位点的设计
• 3.2.7 基因芯片上的杂交反应
• 3.2.8 杂交反应条件的优化
• 3.2.9 基因芯片检测特异性及灵敏度测试
• 3.2.10 两种及两种以上细菌在芯片上的同时检测
• 3.2.11 带菌玉米种子悬浮液的基因芯片的检测
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 细菌计数及DNA 浓度测试
• 3.3.2 PCR 反应中退火温度测定
• 3.3.3 PCR 检测的特异性测试
• 3.3.4 PCR 检测灵敏度测试
• 3.3.5 芯片中杂交条件优化结果
• 3.3.6 基因芯片杂交特异性测试结果
• 3.3.7 基因芯片检测灵敏度测试结果
• 3.3.8 两种或多种细菌同时检测结果
• 3.3.9 玉米种子样品中四种目标菌的基因芯片检测
• 3.4 讨论
• 3.4.1 影响基因芯片检测结果的因素
• 3.4.2 影响多重 PCR 检测结果的因素
• 3.4.3 基因芯片检测中引物与探针的设计
• 3.4.4 基因芯片杂交反应结果分析
• 3.5 本章小结
• 3.5.1 玉米检疫性种传细菌多重 PCR 检测方法的建立
• 3.5.2 基因芯片检测方法的建立
• 3.5.3 基因芯片检测方法特异性测定
• 3.5.4 基因芯片检测方法灵敏度测试
• 3.5.5 基因芯片在玉米种子样品检测中的应用
• 3.5.6 多种病原菌的同时检测
• 第四章 结论
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简历
• 致谢