壳聚糖基组织工程化角膜内皮细胞载体的制备与性质研究

论文摘要

角膜内皮细胞是位于角膜后部的单层细胞,在维持正常角膜脱水状态、角膜厚度以及透明度方面起着关键作用。目前,穿透性角膜移植术是取代病变或受损内皮以恢复角膜透明的唯一方法。但是供体来源的短缺、老年化及术后免疫排斥反应的发生,直接影响着角膜移植手术的开展和成败。近年来随着组织工程技术的发展和角膜细胞组织培养方法的建立,构建组织工程化角膜内皮进行移植来治疗角膜内皮盲成为研究的一个热点。迄今为止,被作为角膜内皮细胞培养贴附载体的材料包括:异体角膜片、明胶薄膜、水凝胶膜、羊膜以及后弹力层膜等,但上述载体各有缺点,制约了其用于临床的深入研究。因此,研制一种适合角膜内皮细胞贴附,且具有良好组织相容性和可控降解性的移植载体成为目前研究的焦点。壳聚糖是甲壳素经脱乙酰基后得到的一种天然聚阳离子功能性生物多糖,具有可生物降解性和无毒副作用等特性,在生物医用材料和组织工程领域得到了广泛的研究和应用。但其生物相容性不能满足眼内植入的需要,限制了其深入研究。本实验从对壳聚糖进行化学改性提高其生物相容性出发,制备了羟丙基壳聚糖,并以此为基本材料,通过与其他多糖的共混,制备出适合角膜内皮细胞生长的载体膜片,以期解决角膜内皮缺损修复的问题。本实验取得了以下几个方面成果和进展:1、以异丙醇为介质,用环氧丙烷与碱化壳聚糖反应合成水溶性羟丙基壳聚糖,并用FTIR、1H-NMR和XRD对其结构进行表征,元素分析法测定其取代度;以MTT法研究该衍生物对兔角膜基质细胞生长的影响。结构分析结果表明:在壳聚糖的C6-OH上成功引入了羟丙基基团;MTT实验结果表明:该衍生物对角膜基质细胞的生长无抑制作用,具有良好的细胞相容性,可望用作工程化角膜支架材料。2、为探讨羟丙基壳聚糖基共混膜作为组织工程技术中角膜细胞培养载体的可行性,分别制备了羟丙基壳聚糖/硫酸软骨素、羟丙基壳聚糖/明胶/硫酸软骨素以及羟丙基壳聚糖/氧化透明质酸/硫酸软骨素三种共混膜。在共混膜上培养兔角膜上皮细胞,通过观察角膜上皮细胞在不同载体膜上的生长状态、贴附情况,测定细胞活性以及上清液中乳酸脱氢酶的活性,研究三种壳聚糖基载体膜片与角膜上皮细胞的相容性。实验结果表明羟丙基壳聚糖/明胶/硫酸软骨素共混膜对细胞的损伤最小,有利于细胞在膜上的贴附和生长,表现出良好的细胞相容性,有望作为角膜细胞载体体外构建组织工程化角膜,确定为本研究的角膜内皮载体材料。3、研究了羟丙基壳聚糖/明胶/硫酸软骨素共混膜的透光性、亲水性、通透性、机械性能、表面结构、蛋白吸附能力以及红外图谱。从体内肌肉植入和眼前房植入两个层面评价了共混膜的生物降解性和组织相容性。结果表明共混膜具有良好的透明性、亲水性和机械性能以及粗糙的表面结构,并且对蛋白有较好的吸附能力。体内植入实验表明:共混膜片能够逐步降解,肌肉植入和眼前房植入显示其具有良好的生物相容性和降解性。其中,共混膜在大鼠肌肉内90天左右基本被降解吸收,组织反应比较温和。植入到兔眼前房,在观察期内没有明显的炎症反应,没有免疫排斥,在植入60天时膜片基本被吸收。4、以羟丙基壳聚糖/明胶/硫酸软骨素共混膜为载体体外构建角膜内皮。观察兔角膜内皮细胞在共混膜上的生长情况,研究共混膜与角膜内皮细胞的相容性,结果表明共混膜片有优良的内皮细胞相容性,体外成功构建角膜内皮,为后续移植奠定了基础。

论文目录

• 缩略语
• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 角膜的解剖组织结构
• 1.1 角膜的大体解剖学
• 1.2 角膜的组织学
• 2 组织工程化角膜的研究进展
• 2.1 组织工程技术概述
• 2.2 角膜内皮损伤修复的研究进展
• 2.3 角膜内皮移植的长处与不足
• 2.4 展望
• 3 壳聚糖基生物材料在组织工程中的应用
• 3.1 壳聚糖及其衍生物
• 3.2 壳聚糖基生物材料在组织工程中的应用
• 4 本论文的提出和研究意义
• 第二章 羟丙基壳聚糖的制备、表征及其对角膜细胞生长的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 材料与仪器
• 1.2 HPCTS的制备与纯化
• 1.3 质量指标的测定
• 1.4 结构表征
• 1.5 HPCTS对兔角膜基质细胞生长的影响
• 2 结果与讨论
• 2.1 壳聚糖的性质
• 2.2 HPCTS的制备
• 2.3 HPCTS性质指标测定的结果
• 2.4 取代度的测定
• 2.5 HPCTS的表征
• 2.6 HPCTS对角膜基质细胞生长的影响
• 3 本章小结
• 第三章 三种壳聚糖基共混膜的制备及其细胞相容性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料与仪器
• 1.2 不同HPCTS共混膜的制备
• 1.3 兔角膜上皮细胞的培养
• 1.4 兔角膜上皮细胞与HPCTS共混膜的相容性研究
• 2 结果
• 2.1 兔角膜上皮细胞在不同HPCTS共混膜上的形态观察
• 2.2 角膜上皮细胞乳酸脱氢酶活性的测定
• 2.3 角膜上皮细胞在不同共混膜上生长活性的测定
• 3 讨论
• 4 本章小结
• 第四章 羟丙基壳聚糖共混膜的理化性质研究及组织相容性评价
• 第一节 羟丙基壳聚糖共混膜的理化性质研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料与试剂
• 1.2 主要仪器
• 1.3 方法
• 2 结果
• 2.1 共混膜的透光性
• 2.2 共混膜的含水量和表面接触角
• 2.3 共混膜的通透性和对蛋白的吸附性
• 2.4 共混膜的力学性能
• 2.5 共混膜的表面微观结构
• 2.6 共混膜的红外光谱分析
• 3 讨论
• 第二节 共混膜片的组织相容性评价
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料与试剂
• 1.2 主要仪器
• 1.3 方法
• 2 结果
• 2.1 肌肉植入
• 2.2 眼前房植入
• 3 讨论
• 4 本章小结
• 第五章 壳聚糖基组织工程化角膜内皮的体外构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料与仪器
• 1.2 兔角膜内皮细胞的培养
• 1.3 壳聚糖基组织工程化角膜内皮的体外构建
• 2 结果
• 2.1 兔角膜内皮细胞原代生长形态的观察结果
• 2.2 兔角膜内皮细胞的传代培养结果
• 2.3 兔角膜内皮细胞在羟丙基壳聚糖共混膜上的形态学观察
• 2.4 角膜内皮细胞乳酸脱氢酶活性的测定
• 2.5 细胞在载体膜片上贴附牢固度的研究
• 3 讨论
• 3.1 角膜内皮细胞的培养
• 3.2 工程化角膜内皮的体外构建
• 4 本章小结
• 总结
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间论文发表情况