普通小麦与拟南芥远缘不对称体细胞杂交的研究

论文摘要

普通六倍体小麦（Triticum aestivum L．）是重要的粮食作物，但由于其基因组庞大，研究相对困难，需要探索新的研究方法。拟南芥（Arabidopsis thaliana）是应用广泛的模式植物，基因组测序已完成，遗传背景相对清晰。本文以普通小麦核生3号胚性愈伤组织来源的原生质体为供体，用紫外线（UV）分别照射30s、1min、2min，再与悬浮细胞系来源的拟南芥原生质体进行PEG介导的细胞融合，希望将小麦染色体小片段，尤其是基因富集区插入拟南芥基因组，从而借助其清晰的遗传背景对小麦基因组进行研究。然而，我们却获得了偏向小麦的再生体细胞杂种细胞系及植株，进一步研究了该远缘杂种的基因组结构和变异。本实验设计的融合组合如下：组合Ⅰ，拟南芥+小麦UV照射30s；组合Ⅱ，拟南芥+小麦UV照射1min；组合Ⅲ，拟南芥+小麦UV照射2min。拟南芥原生质体和UV照射后的小麦原生质体单独培养作为对照。经过大约8周的暗培养，组合Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别获得4个，22个，以及5个再生细胞系。双亲对照培养体系均未能再生细胞系。组合Ⅰ中有两个细胞系表型偏向拟南芥，但继代2次后死亡。其余细胞系表型均偏向小麦。其中7个细胞系可以分化出绿色植株，9个细胞系只再生白化苗，所有植株表型也均偏向小麦。对再生细胞系进行同功酶、RAPD、染色体、叶绿体SSR及胞质基因组PCR-RFLP分析，确定了11个细胞系和1个再生植株的杂种性质。对部分细胞系进行基因组荧光原位杂交（GISH）分析，发现在部分细胞系的个别小麦染色体端部有拟南芥的杂交信号，这表明最终形成了偏向小麦的高度不对称体细胞杂种。由此，我们对远缘杂交和杂种中染色体小片段插入的机制进行了讨论。胞质基因组分析发现，胞质遗传物质均来自于小麦，没检测到拟南芥的遗传物质。叶绿体SSR分析表明，四个细胞系的SSR谱带在所有的7对引物中都异于双亲，且稳定遗传，说明叶绿体基因组可能发生了大范围的重组和重排。另外一个有趣的发现是我们在胞质基因组PCR-RFLP分析中意外得到一段281bp的序列。分析发现，该序列可能是一微型反向重复转座元件（Miniature inverted-repeat transposable element，MITE）的一部分。我们认为该序列仍然来自于核基因组。鉴于双亲该位点均无此序列，且杂种中该位点遗传稳定，我们认为在体细胞杂交过程中可能存在转座元件激活的现象。体细胞杂交过程中的转座元件激活现象还有待进一步证实，而转座元件在细胞杂交中的作用也需要更深入的研究。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略语
• 第一部分 文献综述
• 1. 植物体细胞杂交技术进展
• 1.1 融合方法
• 1.2 融合方式
• 1.3 体细胞杂种的筛选
• 1.4 杂种性质的鉴定
• 2. 植物体细胞杂交的应用
• 2.1 体细胞杂交在作物遗传改良中的应用
• 2.1.1 克服再生障碍创建新种质
• 2.1.2 生物和非生物胁迫抗性的转移
• 2.1.3 转移 CMS 或生产新 CMS 类型
• 2.2 体细胞杂交在基因组作图和基因功能研究方面的应用
• 3. 研究背景及立题意义
• 第二部分 试验部分
• 1. 材料及实验方法
• 1.1 小麦与拟南芥的原生质体融合
• 1.1.1 材料
• 1.1.2 小麦原生质体的制备
• 1.1.3 拟南芥原生质体的制备
• 1.1.4 双亲原生质体的融合与培养
• 1.2 愈伤组织及再生植株的鉴定
• 1.2.1 同工酶分析
• 1.2.2 CTAB 法提取 DNA 样品
• 1.2.3 RAPD分析
• 1.2.4 染色体分析及基因组原位杂交（GISH）分析
• 1.2.5 胞质基因的分析
• 1.2.5.1 叶绿体基因组的SSR分析
• 1.2.5.2 胞质基因组PCR-RFLP分析
• 2. 实验结果
• 2.1 融合产物再生及表型特征
• 2.2 同功酶分析
• 2.3 RAPD分析
• 2.4 染色体数目
• 2.5 GISH核型
• 2.6 SSR分析
• 2.7 PCR-RFLP分析
• 3. 讨论
• 3.1 拟南芥与小麦远缘体细胞杂交获得高度不对称杂种
• 3.2 胞质基因组变化
• 3.3 体细胞杂交过程中的转座元件
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表的文章
• 外文论文
• 学位论文评阅及答辩情况表