论文摘要
系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）是一种常见的系统性自身免疫性疾病,主要表现为T、B淋巴细胞功能异常,产生多种自身抗体（以抗核抗体和抗双链DNA抗体最为重要）和免疫复合物,炎症可累及全身,造成关节、皮肤、肾脏、心、肺、血管等各脏器和组织不可逆的慢性破坏和功能丧失,最终影响生命。其中狼疮性肾炎（lupus nephritis,LN）是系统性红斑狼疮最常见和最严重的并发症,是导致SLE患者死亡的主要原因之一。B7-1分子属于免疫球蛋白超家族成员之一,与表达T细胞表面的相应受体CD28/CTLA-4结合产生共刺激信号,介导T细胞的免疫应答反应;若缺乏此共刺激信号,T细胞将进入无能（anergy）或耐受状态,甚至死亡。应用B7抗体可以阻断B7分子与CD28/CTLA-4的相互作用,进而阻断共刺激信号的传递,引起抗原特异性的无反应性或反应低下。由此可见,通过阻断B7-CD28/CTLA-4共刺激通路有望为自身免疫性疾病、移植排斥、肿瘤免疫等疾病提供新的诊断和治疗方法。本课题运用降植烷（2,6,10,14-tetramethylpentadecane,Pristane）建立与人类SLE相似的小鼠动物模型,并研究B7-1单克隆抗体对狼疮样肾病的治疗作用,为阐明SLE的发病机制和B7-1单克隆抗体在临床中的潜在应用价值提供了理论依据。一、B7-1单克隆抗体的制备及鉴定目的:获得B7-1单克隆抗体纯品并分析鉴定其生物学特性,为治疗小鼠狼疮样肾病提供物质基础。方法:运用本科室成功建立的稳定分泌B7-1单克隆抗体的细胞株4E5,采用体内诱生腹水法制备单抗;ProteinG免疫亲和层析法纯化抗体;流式细胞术方法分析单抗对细胞膜型B7-1分子的识别。结果:经体内诱生腹水法制备单抗,小鼠腹水形成阳性率约为85%,腹水收获量平均为3ml/只小鼠;经免疫亲和层析法纯化,腹水中抗体蛋白的得率为3mg/ml;单抗4E5与细胞株Daudi、Raji、H1299以及小鼠脾脏细胞的阳性结合率分别为88.6%、95.7%、20.6%、48.5%。二、狼疮样肾病小鼠模型的建立及生物学鉴定目的:构建C57BL/6J狼疮样肾病鼠模型,探讨环境因素Pristane在SLE发病机制中的重要作用。方法:8周龄雌性C57BL/6J小鼠30只随机分为两组,造模组予一次性腹腔注射Pristane 0.5ml/只,对照组予一次性腹腔注射生理盐水0.5ml/只。注射后第5、10天用流式细胞术方法（FCM）分别检测脾脏中吞噬细胞（Mφ）、树突状细胞（DC）的活化以及B细胞表面分子的变化情况;每月定期检测血清中抗核抗体（ANA）、抗双链DNA抗体（dsDNA）及尿蛋白;7个月时处死小鼠,通过常规HE染色方法观察小鼠肾脏病理改变以及直接免疫荧光方法检测肾脏免疫复合物（IC）的沉积情况。结果:小鼠腹腔注射Pristane后第5、10天,脾脏中的Mφ、DC均有不同程度活化（p<0.05）,B细胞表面CD21、CD86、MHC-II等分子表达也不同程度上调（p<0.05）;4个月时,造模组小鼠血清中ANA和抗dsDNA抗体的阳性率分别约为80%和89%;7个月时,78%小鼠出现蛋白尿（≥+）,肾脏HE切片显示肾脏出现肾小球肿胀,淋巴细胞浸润等典型的肾脏病理改变,IC沉积。而对照组小鼠血清中ANA、抗dsDNA抗体阴性,未见蛋白尿,肾脏组织未见病理改变。本实验结果显示,Pristane成功诱导了C57BL/6J狼疮样肾病鼠模型,为进一步研究狼疮的干预措施提供了实验对象。三、B7-1单克隆抗体对小鼠狼疮样肾病治疗作用的研究目的:探讨B7-1单克隆抗体阻断B7-1/CD28信号通路对小鼠狼疮样肾病的治疗作用。方法:将8周龄雌性C57BL/6J小鼠随机分为3组,正常对照组给予生理盐水0.5ml/只,造模组与治疗组给予Pristane 0.5ml/只,同时分别给予鼠同型IgG抗体（造模组）或B7-1单克隆抗体（治疗组）200μg/只。第10天分别检测淋巴结和脾脏中Mφ、DC的活化及脾脏B细胞表面活化分子的变化;每月定期检测血清中ANA及尿蛋白;7个月时处死小鼠,HE染色观测肾脏病理变化和冰冻切片直接免疫荧光法观察免疫复合物的沉积情况。结果:第10天,与正常对照组相比,治疗组和造模组小鼠淋巴结和脾脏中Mφ、DC均有不同程度的活化,治疗组活化程度明显低于造模组（p<0.05）,脾脏B细胞表面CD21、CD40、CD86等分子上调程度低于造模组（p<0.05）;4个月时治疗组和造模组小鼠血清均检测到ANA,但治疗组的血清抗体滴度低于造模组（p<0.05）;治疗组7个月时,尿蛋白含量低于造模组,肾脏HE结果显示治疗组小鼠肾脏病理改变轻于造模组,直接免疫荧光检测可见治疗组免疫复合物荧光强度弱于造模组,正常对照组小鼠肾脏没有明显的病理改变。本实验结果显示,B7-1单克隆抗体对小鼠狼疮样肾病具有良好的治疗效果。结论:⑴B 7-1单克隆抗体能够特异性识别细胞株及小鼠脾脏细胞上的膜型分子B7-1;⑵对雌性C57BL/6J小鼠一次性腹腔注射Pristane 0.5ml/只,成功建立了狼疮样肾病小鼠模型;⑶B 7-1单克隆抗体对小鼠狼疮样肾病具有良好的治疗效果,能够减缓Pristane诱导C57BL/6J小鼠狼疮样肾病的发生。
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