粘细菌纤维堆囊菌降解纤维素多酶复合体的确证和性质分析

论文摘要

粘细菌是一类特殊的革兰氏阴性杆菌，能够进行滑行运动，具有复杂的多细胞行为和形态发生过程，是一类“生活在真核生物边缘”的高等的原核生物类群；产生众多结构新颖、作用机制独特的生物活性次级代谢产物是粘细菌的另一重要特征。根据“食性"的差异可将粘细菌简单的划分为溶细菌和溶纤维素两个生理类群。溶纤维素群中只有堆囊菌属一个属，纤维堆囊菌是其中的模式种。作为重要的微生物药物(例如著名的埃博霉素)产生菌，纤维堆囊菌逐渐引起全球的广泛关注。但是，对其最为基本的微生物学特性——粘细菌中唯一能够降解纤维素、半纤维素等生物大分子的类群，相关研究则涉及很少。本文利用实验室所建立的国内最大的粘细菌资源库的优势，对纤维堆囊菌降解纤维素的基本性质及相关酶类进行了研究。 纤维素是地球上最丰富的可再生有机资源，对纤维素的降解基本上是由微生物完成的。不同微生物降解纤维素时所采取的策略也不尽相同，主要表现在各种降解酶类的作用机制和组织形式上。纤维堆囊菌能够在以纤维素为唯一碳源的简单无机盐培养基(如CNST培养基)上生长，可产生多种纤维素和半纤维素酶类。所以，我们从表征其纤维素酶类的基本性质出发，开展了相关研究。广泛选取了13株纤维堆囊菌作为研究对象，对其在不同纤维素底物上的生长形态、降解纤维素特征、分化发育能力以及多种纤维素和半纤维素酶类的产生时间进行了测定和比较。通过对各菌株在滤纸纤维素底物上生长和子实体形成情况的分析，我们将其总结为两种不同的类型：一种类型是以接种点为中心，先向四周快速扩展，在扩展过程中伴随着滤纸纤维素的降解，达到一定程度以后，整个菌落的细胞同时开始聚集，并形成子实体结构，其子实体基本在生长同一时期形成，并布满整个菌落，这种类型的特点就是几乎所有的菌体细胞都处于相同的生长时期，细胞生长和分化发育具有一定的同步性；另一种类型是在菌落外围菌体细胞仍在增殖扩展时，靠近中心部位的菌体则已开始聚集和进入分化发育阶段，首先形成子实体结构，随着培养时间的延长，外围细胞也逐渐形成子实体结构，其子实体最终布满菌落中心部位或整个菌落，这种类型的特点就是菌落中不同部位的细胞所处

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1.1 粘细菌的基本性质
• 1.1.1 粘细菌的分类和分布
• 1.1.2 粘细菌的运动和多细胞行为
• 1.1.3 粘细菌的细胞密度依赖性
• 1.1.4 粘细菌的活性次级代谢产物
• 1.1.5 纤维堆囊菌介绍
• 1.2 纤维素的微生物降解
• 1.2.1 纤维素介绍
• 1.2.2 纤维素酶研究进展
• 1.3 纤维小体（Cellulosome）
• 1.3.1 纤维小体酶组分组成和结构
• 1.3.2 脚手架蛋白
• 1.3.3 细胞表面锚定蛋白
• 1.3.4 纤维小体的研究和应用前景
• 1.4 本文工作开展的思路
• 第二章 纤维堆囊菌菌株的形态观察及降解纤维素性质分析
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 仪器
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 纤维堆囊菌菌株的扩大培养
• 2.2.2 纤维堆囊菌纤维素类底物降解现象和形态变化观察
• 2.2.3 纤维堆囊菌纤维素酶活力测定
• 2.3 实验结果和分析
• 2.3.1 纤维堆囊菌在滤纸上的形态学和降解特征
• 2.3.2 纤维堆囊菌纤维素酶性质分析
• 2.3.3 纤维堆囊菌在不同纤维素底物上的生长和降解情况
• 2.3.4 后续分析模式材料的选择
• 2.4 小结
• 第三章 纤维堆囊菌So9733-1降解纤维素多酶复合体的分离纯化和初步确定
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 仪器
• 3.1.3 试剂
• 3.1.4 培养基
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 菌株So9733-1在滤纸上的细胞行为观察
• 3.2.2 降解纤维素多酶复合体的初步制备
• 3.2.3 纤维素酶活力测定和蛋白含量测定
• 3.2.4 凝胶层析分离
• 3.2.5 SDS-PAGE
• 3.2.6 HPLC分析
• 3.3 实验结果和分析
• 3.3.1 So9733-1在滤纸纤维上的细胞行为
• 3.3.2 降解纤维素多酶复合体的分离和确证
• 3.4 小结
• 第四章 纤维堆囊菌So9733-1降解纤维素多酶复合体的细胞定位分析
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌株、质粒及实验动物
• 4.1.2 仪器
• 4.1.3 试剂
• 4.1.4 培养基
• 4.2实验方法
• 4.2.1 So9733-1木聚糖酶基因片段xynF的异源表达
• 4.2.2 重组蛋白XynF包涵体的提取纯化
• 4.2.3 重组蛋白XynF抗血清的制备和纯化
• 4.2.4 免疫印迹（Western Blotting）
• 4.2.5 间接免疫荧光（Indirect Immunofluorescence）
• 4.2.6 So9733-1木聚糖酶基因xynA、xynB的3D结构预测
• 4.3 实验结果和分析
• 4.3.1 So9733-1木聚糖酶基因片段xynF的异源表达载体构建
• 4.3.2 So9733-1木聚糖酶基因片段xynF的异源表达和重组蛋白XynF的抗体制备
• 4.3.3 So9733-1降解纤维素多酶复合体的免疫印迹
• 4.3.4 So9733-1降解纤维素多酶复合体的细胞定位
• 4.3.5 So9733-1木聚糖酶基因xynA、xynB的3D结构预测
• 4.4 小结
• 第五章 纤维堆囊菌So9766-1降解纤维素多酶复合体组成的初步分析
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 菌株
• 5.1.2 仪器
• 5.1.3 试剂
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 双向电泳
• 5.2.2 蛋白点的银染胶内酶解
• 5.2.3 ZipTip C18除盐浓缩
• 5.2.4 MALDI-TOF MS检测
• 5.2.5 MALDI-TOF MS图谱分析和数据库检索
• 5.3 实验结果和分析
• 5.3.1 So9733-1降解纤维素多酶复合体的双向凝胶电泳
• 5.3.2 降解纤维素多酶复合体胶内酶解片段的PMF分析
• 5.4 小结
• 总结与展望
• 附录
• 参考文献
• 致谢
• 在读博士期间发表的论文
• 学位论文评阅及答辩情况表