大肠杆菌耐药基因acrB、marR的克隆与表达菌株的初步筛选

论文摘要

由于在治疗大肠杆菌病过程中的抗生素频繁、广泛及不合理应用,导致大肠杆菌多重耐药的现象日益严重,大肠杆菌对多种抗生素耐药主要与菌体中存在的外输泵有关。一般认为AcrAB-TolC外输泵是最主要的外输系统,若使该系统失活,大肠杆菌可从多重耐药状态变为相对敏感状态。对大肠杆菌转运基因acrB及其多重耐药操纵抑制基因marR的研究对深入研究大肠杆菌的耐药机制具有重要意义。本论文采用常规方法提取大肠杆菌药敏质控株ATCC25922及5株动物源性不同、耐药水平不同的临床分离多重耐药大肠杆菌的acrB、marR基因的染色体DNA,通过其特异性引物的设计、PCR扩增、PCR产物与克隆载体pMD-18T的连接、连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态中以及对酶切及PCR鉴定为阳性的克隆质粒序列测定,获得了受试菌的acrB、marR全基因序列。测序结果表明,所测得的3株不同动物源性大肠杆菌的acrB基因的核苷酸序列与GeneBank中发表的该基因核苷酸序列的同源性为100%;除1株耐药菌的marR基因未发生突变外,其余的部分碱基均发生了突变,个别氨基酸也发生了变化。与GeneBank中发表的该基因序列对比分析,核苷酸序列的同源性在97.5%-98.2%之间,氨基酸序列的同源性在97.3%-98.6%,其中包括两处共同突变:307位G→A,氨基酸Gly→Ser;409位T→C,氨基酸Try→His。其中鸡源高耐药株的核苷酸突变位点最多。上述耐药株的marR基因突变位点是否影响了marR对AcrAB-TolC外输泵的调控作用,进而影响其多重耐药水平,还有待于进一步研究。在对acrB、marR基因进行克隆及同源性比较分析的基础上,通过对克隆质粒以及表达载体质粒pPICZαA的双酶切、酶切回收产物的连接、连接产物转化至E.coli TOP10感受态中、重组质粒pPICZαA-acrB和pPICZαA-marR的酶切及PCR鉴定、表达重组质粒pPICZαA-acrB和pPICZαA-marR经SacI酶线性化、线性化质粒电转化至GS115酵母感受态细胞中,煮-冻-煮法提取重组酵母基因组,PCR法进行阳性基因整合酵母的筛选,1%琼脂糖凝胶电泳结果显示acrB、marR基因已整合入GS115染色体上,PCR产物的分子量分别约为1.6Kb、1.0Kb。本试验获得的临床分离大肠杆菌耐药基因acrB、marR的核苷酸序列同源性比较分析结果,可为深入研究其AcrAB-TolC外输泵的调控机制提供参考;初步筛选出acrB、marR基因的毕赤酵母表达菌株,将为进一步诱导其在毕赤酵母中表达、制备其抗体,建立快速有效的该基因表达水平检测方法,阐明我国临床分离动物源性大肠杆菌的多重耐药机制奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一篇 文献综述
• 第一章 大肠杆菌耐药性阐述
• 1.大肠杆菌对抗生素的耐药现状
• 2.大肠杆菌耐药性产生的原因
• 3.大肠杆菌耐药性的分类
• 4.大肠杆菌多重耐药机制的研究
• 第二章 大肠杆菌多重耐药Mar操纵调节系统和AcrAB-TolC外排泵的研究
• 1.大肠杆菌Mar操纵调节系统结构分析
• 2.大肠杆菌外排系统结构分析
• 3.AcrAB-TolC外排系统耐药机制及与Mar操纵调节系统的关系
• 4.Mar操纵调节系统与膜耐药的关系
• 5.大肠杆菌多重耐药基因acrB和marR的研究进展
• 6.耐药性研究的目的及意义
• 第二篇 试验内容
• 第一章 动物源性大肠杆菌耐药基因acrB、marR的克隆及同源性分析
• 1.材料
• 2.方法
• 3.结果
• 4.讨论
• 第二章 大肠杆菌耐药基因acrB、marR的毕赤酵母表达菌株的初步筛选
• 1.材料
• 2.方法
• 3.结果
• 4.讨论
• 结论
• 参考文献
• 附表
• 致谢
• 个人简历