中华按蚊防御素基因的克隆、表达及重组蛋白的纯化与生物活性的初步评价

论文摘要

研究背景:以蚊为媒介的传染病,如:疟疾(malaria)、流行性乙型脑炎(epidemic encephalitis B)、丝虫病(filariasis)、登革热(dengue fever)等,是当今社会严重威胁人民生命健康的重要疾病。WHO公布的“十大重点防治的疾病”中,疟疾和丝虫病均位于其中,疟疾更是世界上感染率最高、死亡人数最多的疾病之一。根据2003年国家卫生部统计资料,我国疟疾的发病率为3.00/10万,世界上每年的疟疾死亡人数达270万。登革热的发病率近年也有逐年递增的趋势,并常有局部暴发流行的报道。因此,蚊及蚊媒病的防治仍是迫切需要解决的问题,控制蚊虫是减少蚊媒病的一种有效方法。 昆虫是世界上最大的生物种群,为了适应不同的生态环境,建立了自己高效独特的免疫系统,抗菌肽(antibacterial peptides,ABP)就是其免疫系统中的关键成分。对于外来病原的感染,蚊虫会通过激活其内源的细胞和体液免疫来形成有效的防御体系。目前最为人们所关注的是富含半胱氨酸的一类多肽,称为“防御素”(defensin)。蚊虫的防御素基因首先从埃及伊蚊中克隆,体外实验表明防御素可以抗革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌,对真菌、病毒、原虫和肿瘤细胞均有杀伤作用。当前不少病原菌对已有抗生素逐渐产生抗药性,而新的抗生素发现又极为困难,防御素有可能成为新型的抗菌素、抗病毒素以及抗肿瘤药物。 中华按蚊是我国疟疾传播的重要媒介,目前有关中华按蚊的防御素研究国内外尚未见报道。本研究尝试克隆中华按蚊defensin基因的编码序列,并对其在

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 中华按蚊防御素（defensin）基因的体外扩增、克隆及序列分析
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 材料
• 1.1.2 实验方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 防御素基因的PCR扩增
• 1.2.2 重组质粒的筛选与鉴定
• 1.2.3 测序结果及同源性分析
• 1.2.4 防御素基因3’端PCR扩增
• 1.2.5 重组质粒的筛选与鉴定
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 第二章 中华按蚊防御素基因重组表达质粒的构建及鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 重组表达载体粒pET32a（+）-tDEF的酶切及PCR鉴定
• 2.2.2 工程菌pET32a（+）-tDEF／BL21的诱导表达鉴定
• 2.2.3 免疫印迹（Western-blot）检测结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 第三章 重组蛋白的表达、纯化及其生物活性的初步评价
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 pET32a（+）-tDEF在大肠杆菌中的表达及可溶性分析
• 3.2.2 表达产物的纯化结果分析
• 3.2.3 表达产物的免疫印迹分析
• 3.2.4 重组融合蛋白的体外抑菌试验鉴定
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 总结
• 参考文献
• 缩略词表
• 综述
• 附录
• 硕士期间发表论文情况
• 致谢
• 声明