论文摘要
目的人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）自1981年发现以来,在全球以惊人的速度蔓延,已成为人类健康和社会进步的大敌。由于HIV高度变异的生物学特性,艾滋病（Acquired Immunodeficiency Syndrome,AIDS）目前尚无法彻底治愈,也无有效的疫苗问世。理想的疫苗应能够诱发高滴度的中和抗体和特异性的细胞毒T淋巴细胞（Cytotoxic T Lymphocyte,CTL）应答。HIV的中和抗体是指机体感染病毒后由B淋巴细胞产生的能够与HIV病毒结合并具有抑制或阻止其识别、结合感染宿主细胞功能的特异性抗体。HIV-1主要免疫原为gp160,由gp120和gp41三聚体组成,由于跨膜蛋白gp41结构线性且相对保守,在融膜过程中发挥关键作用,所以针对gp41结构域的中和抗体研究是目前疫苗研究的新靶点。分析gp41保守表位及gp41中和抗体的水平是针对gp41疫苗设计的基础与关键。识别gp41近膜端的两个单克隆抗体2F5和4E10,具有广泛中和活性,晶体结构及结合位点明确。近期研究显示,2F5和4E10及其组合在体外能够中和不同亚型分离株,保护免疫动物不受HIV感染,且HIV感染者被动输入2F5及4E10单抗时能够使病毒反弹延迟。中和抗体逃逸和中和抗体的浓度是影响中和抗体发挥作用的关键因素之一。国外近年发现,随着疾病进展,gp41中和抗体识别表位氨基酸发生不同程度的突变,使得中和抗体能力下降或消失。有研究表明泰国CRF01 AE无症状HIV-1感染者血浆中的2F5抗体水平高于AIDS患者。对中和抗体抗原表位的研究是分析抗原分子的结构与功能、抗原抗体反应机制的基础。寻找与中和抗体特异性结合的gp41模拟表位及分析相应的抗原表位将有助于设计免疫原诱导保护性抗体,CSGKLIC（gp41 603～609aa）和ERDRD（gp41 746～750aa）是最近发现的gp41中和表位。目前,对于我国流行HIV gp41中和表位及中和抗体的研究仍是空白。由于存在人种的免疫特异性及遗传背景差异,且我国流行的HIV毒株不同于国外,使得对于中和抗体的研究无法照搬国外研究结果,因此急需掌握我国HIV gp41中和表位变异及中和抗体水平的基本情况。本研究以中国HIV-1感染者为对象:分析gp41中和抗体保守表位变异与亚型、疾病进程的相关性;探讨gp41的中和抗体水平与疾病进程及中和能力的相关性;应用噬菌体随机肽库寻找gp41抗体识别的模拟性表位,为中国HIV-1 gp41中和抗体的免疫治疗和疫苗设计奠定理论基础。方法1、研究对象河南省、云南省、辽宁省HIV血清抗体阳性感染者92例,平均年龄40.4岁,男62例,女30例,通过性传播途径感染者17人,采供血传播途径感染者54人,静脉吸毒途径感染者21人。无菌采静脉血5ml（EDTA抗凝）,所有标本均在未接受抗病毒治疗前采集。HIV阳性全部由艾滋病确认实验室经Western blot试验确认阳性。根据疾病进程分为疾病缓慢进展者（slow progressor,SP）组24例、无症状HIV感染组（Asympomatic individuals,AS）34例、AIDS组34例。分组标准为:SP,CD4+T淋巴细胞≥500×106/L,HIV感染10年以上,未经抗病毒治疗,无艾滋病指征性疾病;AS,200×106/L＜CD4+T淋巴细胞≤500×106/L,无艾滋病指征性疾病;AIDS,CD4+T淋巴细胞＜200×106/L和/或伴有指征性疾病。HIV-1根据env、gag及pol分型。其中B′亚型54例,CRFB′C亚型24例,CRF01AE亚型10例,B亚型4例。所有受试对象均签有知情同意书。2、CD4+T淋巴细胞测定20μl CD4/CD8/CD3 TriTEST试剂加入TruCOUNT管中,加入50μl抗凝血,室温避光15min,加入免洗溶血素450μl,室温避光15min,用FACS MMLTISET软件检测并进行自动分析、计算CD4+、CD8+、CD3+ T淋巴细胞绝对值及相应比值等。3、病毒载量测定以200μl血浆采用标准版模板制备法提取RNA,采用Roche公司HIV-1Monitor 1.5 commercial kit在COBAS AMPLICOR自动载量仪上以RT-PCR方法测定病毒载量。检测范围为400-750,000copies/ml。4、病毒核酸提取以抗凝全血和200μl血浆提取前病毒DNA和病毒基因组RNA,按照QIAampwhole blood Mini Kit和QIAamp Viral RNA Mini Kit说明书步骤提取DNA或RNA,提取物溶于100μl洗脱液中。5、巢氏聚合酶链反应（nest-PCR）以外侧引物对:gp41-1(5’-TCT TRG GAG CAG CAG GAA GCA CTA TGGG-3’HIV-1HXB2 7789-7816nt)和gp41-2(5’-AAC GAY AAJ GGT GAR TAT CCC TGCCTAA-3’ HIV-1HXB2 8374-8347nt);内侧引物对:gp41-3(5’-ACA ATT ATT GTC TGGTAT AGT GCA RCA GCA-3’ HIV-1HXB2 7850-7879nt)和gp41-4(5’-TTA AAC CTAYCA AGC CTC CTA CTA TCA TTA-3’ HIV-1HXB2 8310-8281nt)用于扩增HIV-1gp41序列。6、PCR反应产物纯化取终产物5μ1进行1%琼脂糖凝胶电泳,经Ultra-Violet Product凝胶成像后与marker比对,确认所需片段,用QIAquik Gel Extraction Kit试剂盒纯化基因片段。7、TOPO-TA克隆扩增的gp41基因461bp片段插入克隆载体pCR4TOPO? TA vectors,转入化学感受态菌DH5a扩大培养,然后提取质粒DNA双脱氧终止法测序。8、PCR反应产物测序将纯化后的PCR产物,以gp41-s1(5’-CAA TTA TTG TCT GGT ATA GTG C-3’HIV-1HXB2 7851-7872NT)、gp41-s2(5’-CAA GCC TCC TAC TAT CAT TA-3’ HIV-1HXB28300-8281nt)为测序引物进行测序反应。测序使用美国Applied Biosystem公司的BigDye Terminator Sequencing试剂盒和ABI 377型DNA测序仪。9、序列分析经PCR扩增和测序得到HIV-1 gp41基因的基因序列片段,然后将这些序列用BIOedit软件包中CLUSTAL W程序进行序列排列比对,并在核苷酸序列中人工引入gaps以保持翻译完整性。应用BIOedit软件处理原始核苷酸序列,参照测序谱图进行基因序列修订后,翻译为氨基酸序列,与HIV-1 Sequence Database参考毒株HXBII[GenBank:K03455]中和抗体表位数据比较。本实验中gp41克隆序列已被Genbank接收:位置号EU542544-EU542575、EU569776-569829。10、HIV-1中和抗体实验提取正常人PBMC,PHA刺激3d,IL-2（20U/ml）培养1d,调整细胞浓度为1×105/ml。于96孔细胞培养板,每孔加入500TCID50 SF33病毒存液与系列稀释血浆,同时设阳性对照（不加血浆）和阴性对照（培养液）,37℃,5%CO2孵育2h后,加入正常人PBMC 100μl╱孔。7d后测上清p24含量,p24检测按说明书进行操作。中和抗体水平以IC50表示。11、ELISAgp41抗原肽0.1μg/ml,4（ELDKWA）-C肽段5μg/ml包被高吸附力96孔酶标板,4℃过夜,PBS（3%BSA）封闭。PBST（0.05%Tween 20）洗板,加入稀释待测标本,37℃1h,PBST洗板,加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG（1:5000）100μl于各检测孔。加入TMB50μl室温显色15min。2M硫酸50μl终止反应,450nm波长读取OD值。12、分离血浆IgG用山羊抗人IgG包被Dynabeads M-280 Tosylactivated,加入1:100稀释的血浆样本,血浆中的IgG结合吸附于磁珠表面,4℃备用。具体操作依DYNAL说明书进行。13、亲和淘筛及阳性克隆筛选将1.5×1011个噬菌体（10μl文库）加入装有结合血浆样本IgG的磁珠内,淘筛步骤按NEB公司的产品说明书进行,第一、二轮淘筛为HIV阳性血浆样本,TBST中Tween-20浓度从0.1%增至0.5%。第三轮为阴性淘筛,血浆标本为HIV阴性的正常对照。随机挑取第3轮分隔良好的蓝色噬菌斑,扩大培养后进行ELISA分析及DNA序列测定。14、噬菌体提取每一个要鉴定的噬菌斑克隆,取5μl噬菌体上清接种1管ER2738于20mlLB培养基中,37℃培养4.5h,10,000rpm离心10min,再离心。取80%上清于新EP管中,加1/6体积的PEG/NaCl。4℃沉淀至少1小时或过夜。沉淀重悬于1ml TBS中,悬溶液转入EP管中,4℃离心5min除去沉淀中的残留细胞。上清移入新的EP管,加1/6体积的PEG/NaCl再次沉淀。冰上作用15-60min,4℃离心10min,弃上清,再行短暂离心,吸去残余上清。沉淀重悬于50μl TBS中,测定噬菌体滴度后,进行ELISA检测挑选阳性克隆。15、ELISA检测挑选阳性克隆抗M13抗体10μg/ml包被96孔板,4℃过夜。5mg/ml BSA封闭1 h,加入提取的噬菌体37℃1 h,分别加入稀释的HIV阳性血浆（12份HIV阳性感染者血浆组成阳性血浆池）和阴性血浆（12份HIV阴性正常对照血浆组成阴性血浆池）100μl,4℃过夜。充分洗涤后,加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG,TMB显色,2M浓硫酸50μl终止反应,450nm读数。根据OD值确定HIV-1特异性的阳性克隆。16、噬菌体单链DNA提取、测定PEG/NaCl沉淀单个噬菌斑扩增液上清,加入碘化物缓冲液、无水乙醇混匀,用70%乙醇500μl漂洗,30μl TE悬溶。应用phd1-（5’-TTC GCA ATT CCT TTAGTG-3’）,phd2-（5’-TTT GTC GTC TTT CCA GAC GT-3’）扩增目的片段170bp,1.5%琼脂糖凝胶确认。以phd2为测序引物测序。根据噬菌体肽库试剂盒说明书所提供的插入片段和密码子表,应用BIOedit软件对测定结果确定阳性克隆的插入片段序列进行翻译。与HIV Data Base数据库中序列B.TH.90.BK132 ACCAY173951进行比对,确定氨基酸同源性。17、噬菌体多肽竞争抑制实验gp41抗原肽0.1μg╱ml（100μl╱孔）包被96孔酶标板,4℃孵育过夜,设内对照、BSA阴性对照和空白对照。封闭缓冲液4℃封闭。TBST（0.5%Tween-20）洗板,取gp41优势表位噬菌体1010病毒子4倍系列稀释并同HIV-1阳性血浆（1:800）分别加入各孔中,室温孵育2h,TBST洗板,加入HRP标记的羊抗人IgG,震荡1h,再次洗板,TMB显色15min,2M硫酸终止反应,450nm读数。18、统计学处理SPSS 11.5统计软件进行统计分析,Yates校正的x2检验并计算P值或双尾Fisher’s精确概率检验计算组间突变频率的差异。计量资料以（?）±SD表示,病毒载量以Median表示。多组间比较用方差分析,两组间应用独立样本t检验。中和抗体滴度取自然对数后,进行Mann-Whitney U检验。相关分析做Spearman相关性检验。结果1、中国HIV/AIDS患者HIV-1 gp41 2F5、4E10中和表位变异情况92例HIV/AIDS患者中,两个中和抗体表位氨基酸均存在突变,2F5（ELDKWA）变异率为21.73%（20/92）、4E10（NWFDIT）变异率为36.95%（34/92）。2F5保守表位突变有E662A/K/S（14.1%/3.3%/3.3%）,K665S/E/Q（17.4%/2.2%/1.1%）,A667K/N（16.3%/1.1%）;4E10保守表位突变有N671S/D（13.0%/1.1%）,D674S/G/N（3.3%/2.2%/1.1%）,T676S（16.3%）。2、B′亚型,CRFB′C亚型及CRF01AE亚型患者2F5、4E10中和表位变异比较中国HIV/AIDS患者B′亚型,CRFB′C亚型及CRF01AE亚型患者2F5（ELDKWA）表位突变例数（突变率）分别为3/54（5.55%）、16/24（66.66%）和0/10（0%）,具有显著性差异（P＜0.05）,其中CRF01 AE分别与B′亚型和CRFB′C亚型比较,具有显著性差异（P＜0.05）。B′亚型、CRF B′C亚型及CRF01 AE亚型,患者4E10（NWFDIT）表位突变例数（突变率）分别为16/54（29.62%）、14/24（58.33%）和3/10（30%）,具有显著性差异（P＜0.05）。其中B′亚型与CRFB′C亚型具有显著性差异（P＜0.05）。3、HIV-1 B′亚型SP、AS与AIDS患者2F5、4E10中和表位变异情况SP组、AS组和AIDS组2F5（ELDKWA）表位突变例数（突变率）分别为1/16（6.25%）、0/15（0%）和2/23（8.69%）,组间无差异（P＞0.05）。SP组、AS组与AIDS组4E10（NWFDIT）表位突变例数（突变率）分别为1/16（6.25%）、4/15（26.67%）和11/23（47.82%）,具有显著性差异（P＜0.05）。4、HIV-1感染者序列变异的短期观察及准种变异情况比较B′亚型同时期的DNA与RNA序列,发现RNA序列与前病毒DNA具有一定的差异。3名HIV-1感染者病毒RNA序列与DNA序列存在着E662A,N671S和S676T新增突变。对16名未接受抗病毒治疗的HIV-1感染者的随访发现ELDKWA基序的主要变异有E662A（1/16）和D674E（1/16）,而NWFDIT表位则有N671S（1/16）和T676S（4/16）的变异。对3例血浆HIV-1病毒RNA进行克隆分析,32条克隆序列的系统进化树显示高度的特异性。第一次采样病毒RNA克隆序列中均未发现两个表位的变异,与RNA测序结果一致,而1年后的序列显示了不同水平的表位变异,其中样本HA48未发现变异,样本HA31的2F5表位存在E662K变异（4/5）,而样本HA114的两个表位均存在突变,分别为E662K（4/8）,K665E（5/8）,D674S（1/8）和D674N（3/8）。5、HIV-1感染者血浆中和抗体水平34例HIV-1感染者血浆经ELISA及体外中和实验检测,SP组的2F5抗体水平显著高于AIDS组（P＜0.05）,亦高于无症状HIV感染者,但不具有统计学意义（P＞0.35）。无症状HIV感染者2F5抗体水平亦高于AIDS组,差异无统计学意义（P＞0.05）;SP组的gp41特异性抗体水平显著高于AIDS组,三组之间无显著性差异;SP、无症状HIV感染者及AIDS患者中和抗体IC50平均滴度分别为160.33,104.29,60.67。SP中和抗体滴度显著高于AIDS患者（P＜0.05）,具有显著性差异;SP中和抗体滴度亦高于无症状HIV感染者（P＞0.05）,无显著性差异。HIV感染者与AIDS患者中和抗体水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）;2F5抗体水平与gp41特异性抗体滴度呈正相关（P＜0.05）,与总的中和抗体水平不相关（P＞0.05）。6、噬菌体文库模拟性表位的筛选应用噬菌体随机12肽展示库（phD12）对2例具有高滴度中和抗体水平的HIV-1阳性血浆及HIV-1阴性血浆IgG进行了3轮筛选,第3轮淘选的噬菌体感染ER2738后,随机挑取分隔良好的48个蓝色噬菌斑,制备噬菌体原种。经阳性筛选得到C8等22例阳性克隆并进行序列测定。阳性克隆12肽与B.TH.90.BK132ACC AY173951比较氨基酸序列的一致性,确定可能的抗体表位。C14与C15、C31序列相同,位于gp120 C1区,C10位于V1环,C22位于C2区,C23位于C4区。其它六个肽段的表位位于gp41,C8、C30和C43氨基酸序列近B30（m）表位,C18与C48位于gp41胞质尾区。C40位于gp41的CHR,对HIV-1阳性血浆具有较高的抑制率（46.3%）,该表位很有可能成为制备抗HIV-1抗体有效的免疫原。结论1、中国92例HIV/AIDS患者HIV-1包膜蛋白env gp41段中和抗体2F5、4E10中和表位氨基酸存在突变,且变异多样化。不同亚型中和抗体保守表位氨基酸位点变异有差异;2、B′亚型4E10中和抗体表位变异可能与疾病进程有一定联系。中国HIV-1感染者自然状态下的血浆病毒中和表位变异可导致2F5和4E10单抗完全或部分逃逸;3、中国SP体内2F5抗体水平高于AS和AIDS患者,可能是疾病不进展的相关因素,2F5抗体水平与gp41特异性抗体呈正相关,与总的中和抗体水平无相关性,HIV-1感染者体内存在其它与中和能力相关的抗体发挥着重要的中和作用;4、利用SP血浆IgG抗体筛选噬菌体随机肽库,是获得HIV-1抗体相关抗原摸拟表位的有效途径,得到的gp41相关表位的克隆可竞争抑制HIV-1阳性血浆与gp41肽段的结合,为进一步设计研究HIV-1抗体提供实验室依据。