论文摘要
目的在不添加饲养层细胞的条件下对新西兰兔（New-Zealand Rabbit）角膜缘干细胞进行培养,观察胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）浓度和种植密度对其生物学特性的影响,确定角膜缘干细胞培养适宜的血清浓度和种植密度,据此建立兔角膜缘干细胞体外无饲养层培养体系,为构建组织工程化角膜及角膜基础研究积累实验资料。方法（1）先用DispaseⅡ酶将新西兰兔角膜缘组织消化成单个细胞,再用含5%,10%和20%胎牛血清的培养液制成等密度的细胞悬液,不添加饲养层细胞,直接种植于底物,观察原代培养时不同血清浓度下角膜缘干细胞的生长状况、检测48h贴壁率;MTT法检测其增殖活性;原代培养第5d行p63和角蛋白K3免疫荧光染色分别检测角膜缘干细胞和分化细胞含量。（2）第2代细胞以2.5×104个细胞/ml和5×104个细胞/ml两种密度种植,观察细胞生长情况并于第1d、第3d和第5d行p63和角蛋白K3免疫荧光染色检测角膜缘干细胞含量及其原始细胞特性的维持状况。结果（1）在不添加饲养层细胞的培养条件下,5%FBS组48h小时贴壁率最低,与10%FBS组和20%FBS组比较差异均具有统计学意义（P＜0.001）,随着培养时间的延长,悬浮细胞逐渐老化死亡,且贴壁细胞不能融合形成单层;10%FBS组和20%FBS组细胞贴壁后状态良好,生长旺盛,分别于接种8.00±0.75d和7.08±0.52d形成单层,两组间贴壁率和融合时间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。MTT生长曲线显示,5%FBS组细胞增殖速度较慢,不能形成对数增殖期。10%FBS组和20%FBS组角膜缘干细胞的对数增殖期大约在第4～7d,之后增殖缓慢,进入生长平台期。免疫荧光染色5%FBS组、10%FBS组大部分细胞p63阳性角蛋白K3阴性,相比之下20%FBS组p63阳性率较低,角蛋白K3阳性率较高,5%FBS组和10%FBS组与20%FBS组p63和角蛋白K3阳性表达率比较差异均具有统计学意义（P＜0.001）。（2）传代后以不同密度种植,低密度组p63和角蛋白K3阳性率随着培养时间的变化较小;高密度组细胞在传代第3d已接近融合,p63阳性率显著下降,角蛋白K3表达明显增多,第5d p63阳性率进一步下降,高密度组第3d和第5d p63和角蛋白K3阳性率与第1d比较差异均具有统计学意义（P＜0.001）。结论（1）采用细胞悬液法在体外无饲养层条件下可以成功分离和培养出具有高增殖能力的新西兰兔角膜缘干细胞;（2）在培养体系中加入10%胎牛血清,既可以保证原代培养的新西兰兔角膜缘干细胞有较高的贴壁率,同时又能抑制其分化;（3）在进行传代培养时,采用低密度种植更有利于角膜缘干细胞特性的维持。
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