灰飞虱体内Wolbachia的感染特点及灰飞虱与Wolbachia的系统发育研究

论文摘要

Wolbachia是迄今已知的分布最广泛的胞内共生菌之一,自然界约有16%的昆虫受到其感染,由于Wolbachia可以改变宿主的生殖行为,导致细胞质不相容、雌性化和孤雌生殖等现象,成为近来研究的热点。灰飞虱（Laodelphax striatellus Fallén）是水稻上一种危害严重的昆虫,近年来由其传播的水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）在我国广大稻区流行,造成了严重的损失。本研究选择灰飞虱为材料,对其体内Wolbachia的感染特点进行了研究,并对Wolbachia和灰飞虱的系统发育进行了分析。以期明确灰飞虱体内Wolbachia的感染特点、分类地位、进化关系等问题,同时为利用媒介昆虫-共生菌技术（Vector-Insect-Symbiont Technology,VIST）防治水稻条纹叶枯病提供有益的借鉴。使用DIBA法和PCR法分别对灰飞虱体内水稻条纹病毒和Wolbachia的感染特点进行了研究,结果发现:1、灰飞虱体内广泛存在Wolbachia感染。本试验测定的灰飞虱群体Wolbahia的感染率都比较高,最高达88.89%;2、无论是无毒灰飞虱还是带毒灰飞虱,雄虫群体的Wolbachia感染率都明显高于雌虫群体。但是在灰飞虱带毒群体和无毒群体之间,Wolbachia感染率未发现明显差异,暗示了RSV对Wolbachia感染影响甚微。3、无论是对个体还是对群体,灰飞虱体内RSV和Wolbachia经卵传递均未表现明显的相关性,并且Wolbachia在灰飞虱体内经卵传递率亦未达到100%。对9个地理来源的灰飞虱种群体内共生菌Wolbachia的wsp基因进行测序,结合GenBank中已有wsp基因序列进行系统发育分析,得出如下结果:1、不同地理来源（中国、日本、泰国）灰飞虱种群体内Wolbachia同源性很高,原因可能是灰飞虱体内Wolbachia在不同地理来源种群间存在横向传播,也可能是灰飞虱存在着不同地理来源的种群间存在交流并且Wolbachia随着这种交流而扩散。2、对已有灰飞虱、白背飞虱和褐飞虱种群及1种灰飞虱寄生螯蜂wsp基因序列的系统发育分析结果表明:目前已有的白背飞虱、灰飞虱与其寄生蜂体内Wolbachia亲缘也较近,说明该菌可能在白背飞虱、灰飞虱及其寄生蜂之间存在横向的水平传播;而褐飞虱体内的Wolbachia与灰飞虱及白背飞虱体内的亲缘关系则较远。3、与已有来源于其他节肢动物体内Wolbachia的wsp基因株系比较,发现本实验涉及的灰飞虱和白背飞虱种群都属于B大组、Con亚组的wStri株系。对这9个地理来源的灰飞虱和1个白背飞虱种群CoⅡ（Cytochrome oxidaseⅡ）基因的测序结果分析,发现:1、灰飞虱CoⅡ基因的同源性都在99%以上,这一方面暗示了灰飞虱地理种群之间的差异可能非常小,另一方面也反映了CoⅡ基因不适合研究灰飞虱地理种群的划分。2、CoⅡ基因在灰飞虱与白背飞虱种群间的同源性为80%左右,表现出了种间差异,这说明CoⅡ基因较适合用于亲缘关系较近的种间的系统发育研究。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 水稻条纹叶枯病的研究现状
• 1.1.1 水稻条纹叶枯病的症状特点
• 1.1.2 水稻条纹叶枯病的危害损失
• 1.1.3 水稻条纹病毒的传播介体与寄主范围简介
• 1.1.4 水稻条纹叶枯病的防治研究概况
• 1.1.4.1 抗病品种、抗病育种控制病害
• 1.1.4.2 化学防治控制介体灰飞虱
• 1.1.4.3 基因工程控制水稻条纹叶枯病
• 1.1.4.4 生态调控控制水稻条纹叶枯病
• 1.2 RSV 传播介体灰飞虱的生物学特性及相关研究进展
• 1.2.1 灰飞虱的地理分布
• 1.2.2 灰飞虱在江苏的分布及生活史
• 1.2.3 灰飞虱的获毒、持毒能力及卵传规律
• 1.2.4 昆虫种间及种群进化关系研究相关基因介绍
• 1.3 Wolbachia 研究进展
• 1.3.1 灰飞虱相关内共生菌简介
• 1.3.2 Wolbachia 形态及在体内的分布
• 1.3.3 Wolbachia 系统分化
• 1.3.4 Wolbachia 的宿主分布
• 1.3.5 Wolbachia 在宿主间的传播
• 1.3.6 Wolbachia 对宿主生殖活动的调节及其研究意义
• 1.3.6.1 引起细胞质不亲和
• 1.3.6.2 诱导孤雌生殖
• 1.3.6.3 杀雄作用
• 1.3.6.4 诱导雌性化
• 1.3.7 Wolbachia 的分子检测技术
• 1.4 本论文研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 灰飞虱体内Wolbachia 感染特点
• 2.1.1 试验材料、试剂
• 2.1.2 灰飞虱体内Wolbachia 感染的测定
• 2.1.2.1 灰飞虱的处理
• 2.1.2.2 斑点ELISA（间接DIBA 法）检测RSV
• 2.1.2.3 PCR 检测Wolbachia
• 2.1.3 RSV 与Wolbachia 经卵传播相关性
• 2.1.3.1 产卵后雌成虫RSV 与Wolbachia 检测
• 2.1.3.2 F1 代若虫RSV 与Wolbachia 检测
• 2.2 Wolbachia wsp 基因与灰飞虱CoII 基因的克隆与测序
• 2.2.1 试验材料、试剂
• 2.2.2 灰飞虱总DNA 的提取及质量检测
• 2.2.3 Wolbachia wsp 基因的克隆与测序
• 2.2.3.1 wsp 基因的获得
• 2.2.3.1.1 PCR 扩增体系和条件
• 2.2.3.1.2 扩增产物的电泳检测
• 2.2.3.1.3 PCR 产物的纯化
• 2.2.3.2 质粒载体的连接反应和转化
• 2.2.3.2.1 连接反应
• 2.2.3.2.2 感受态细胞的制备
• 2.2.3.2.3 转化反应和细菌培养
• 2.2.3.3 质粒的提取及酶切鉴定、测序
• 2.2.3.4 wsp 基因序列分析
• 2.2.4 灰飞虱CoII 基因的克隆与测序
• 2.2.4.1 CoⅡ基因的获得
• 2.2.4.1.1 PCR 扩增体系和条件
• 2.2.4.1.2 扩增产物的电泳检测
• 2.2.4.1.3 PCR 产物的纯化
• 2.2.4.2 质粒载体的连接反应和转化
• 2.2.4.3 质粒的提取及酶切鉴定、测序
• 2.2.4.4 CoⅡ基因序列分析
• 3 结果与分析
• 3.1 灰飞虱体内Wolbachia 感染特点
• 3.1.1 灰飞虱体内广泛存在Wolbachia 的感染现象
• 3.1.2 灰飞虱♀、♂群体间Wolbachia 感染的特点
• 3.1.2.1 无毒灰飞虱♀、♂群体间Wolbachia 感染差异比较
• 3.1.2.2 带毒灰飞虱♀、♂群体间Wolbachia 感染差异比较
• 3.1.2.2.1 高带毒率灰飞虱♀、♂群体间感染差异
• 3.1.2.2.2 100%带毒灰飞虱♀、♂群体间感染差异
• 3.1.3 灰飞虱体内RSV 侵染对Wolbachia 感染的影响
• 3.1.4 Wolbachia 与RSV 经卵传播相关性
• 3.2 Wolbachia 与灰飞虱系统发育分析
• 3.2.1 Wolbachia 系统发育分析
• 3.2.1.1 Wolbachia wsp 基因的PCR 扩增
• 3.2.1.2 Wolbachia wsp 基因序列比较与同源性分析
• 3.2.2 灰飞虱的系统发育
• 3.2.2.1 灰飞虱CoⅡ基因的PCR 扩增
• 3.2.2.2 灰飞虱CoⅡ基因序列比较与同源性分析
• 4 结论与讨论
• 参考文献
• 致谢