论文摘要
癌基因、抑癌基因和DNA修复基因并称为三大肿瘤相关基因。DNA修复基因突变、功能的异常和表达水平的改变可以引起前两者DNA损伤修复的异常,而癌基因、抑癌基因突变的积累最终可导致肿瘤的发生。DNA聚合酶β（DNApolymeraseβ,DNA polβ）是参与DNA碱基切除修复的主要聚合酶之一,高表达的polβ还具有参与DNA复制、基因重组、跨损伤合成等功能,但是polβ缺乏3′-5′的校读功能,在DNA复制中保真度最低,造成基因组的不稳定性。polβ的改变与肿瘤发生发展的关系已在一些肿瘤和研究中得到证实。我们的前期研究发现食管癌组织中存在polβ基因的突变和高表达。肿瘤细胞中存在信号转导途径的异常,一些信号分子的过度表达或组成型激活,这将导致这些信号分子下游信号途径的增强,引起细胞的转化、增殖、抵抗细胞凋亡、促进细胞存活,与肿瘤的发生、发展密切相关。研究显示polβ的高表达是转录因子的活化和调节完成的,polβ基因启动子中含有cAMP反应元件（Cyclic-AMP response element,CRE）,转录因子CREB/ATF家族成员（包括CREB、ATF1/2,CREM-1等）能识别CRE基序,促进polβ基因的转录表达。转录因子的激活既是基因表达调控的一个主要事件,又是细胞内信号通路中信号传递过程的重要环节。因此研究参与polβ表达的信号通路,探讨其在肿瘤发生、发展中的作用,寻找可能的肿瘤治疗的新靶点将具有重要价值。互隔交链孢霉是河南省食管癌的重要发病因素,其主要代谢物互隔交链孢酚（alternariol,AOH）（又称链格孢酚）具有致癌性。研究显示AOH能够损伤DNA。一般而言,DNA损伤作为一种信号,将诱导细胞应激反应,激活DNA修复系统基因,使表达增高,以修复损伤。AOH能否激活一定的细胞信号系统,上调polβ表达,尚不清楚。由于伦理学问题使正常食管上皮取材困难,再加上正常食管上皮原代细胞扩大培养的难度的限制,故本课题选取毒理学实验中常用的NIH3T3细胞为靶细胞,拟从观察AOH对NIH3T3细胞的毒性和DNA损伤作用及转化能力入手,寻找AOH激活NIH3T3细胞中DNA polβ表达增高的信号转导通路。在此基础上,进一步研究食管癌EC9706细胞中这些信号通路的状态,探讨在食管癌细胞中这些信号通路与polβ表达的关系。然后利用阻断信号通路的方法,降低相关信号分子的活化、减少polβ表达,观察对食管癌EC9706细胞生物学特性的影响和对化疗药物顺铂的敏感性的改变,为食管癌的治疗提供新的思路。第一部分AOH对NIH3T3细胞生物学特性的影响和激活DNA polβ表达的信号通路研究第一章AOH对NIH3T3细胞生物学特性的影响和诱导DNA polβ表达方法1.以1.0,2.0,10.0,20.0,50.0μmol/L的AOH分别作用NIH3T3细胞24 h和48 h,MTT法观察不同浓度的AOH对细胞增殖的影响;以1.0,2.0,10.0,20.0,50.0μmol/L的AOH作用NIH3T3细胞4 h,单细胞凝胶电泳实验观察AOH对DNA损伤程度;以1.0,2.0,10.0,20.0,50.0μmol/L的AOH作用NIH3T3细胞24 h,流式细胞术（FCM）检测AOH对NIH3T3细胞周期的影响;以1.0,2.0,10.0,20.0,50.0μmol/L的AOH作用NIH3T3细胞48 h,将存活细胞传代后,重复刺激48 h,将细胞接种在六孔板中（150个/孔）,克隆形成率实验观察AOH对NIH3T3细胞的转化作用。2.分别用2.0,10.0,20.0μmol/L AOH作用NIH3T3细胞16 h,采用RT-PCR、免疫细胞化学法和Western Blotting检测不同浓度的AOH对NIH3T3细胞中polβmRNA和蛋白水平表达的影响。结果1.一定浓度的AOH抑制NIH3T3细胞增殖1.0μmol/LAOH作用24 h和48 h吸光度值与对照组相比无统计学差异（P＞0.05）;2.0μmol/L以上各浓度组24 h和48 h的吸光度值均较对照组降低,差异有统计学意义（P＜0.05）,显示明显的浓度依赖关系。2.AOH损伤NIH3T3细胞DNA计算出各组细胞的尾部DNA含量,发现1.0,2.0μmol/L AOH剂量组与对照组无明显差异,10.0,20.0,50.0μmol/L AOH组均高于对照组（P＜0.05）,且50.0μmol/L组高于10.0,20.0μmol/L组,说明AOH可造成DNA损伤,且存在浓度依赖性。3.AOH引起NIH3T3细胞周期G2/M期阻滞1.0μmol/L和2.0μmol/L组细胞周期与对照组相比,无明显变化。随着AOH浓度的增加,G2/M期细胞百分比逐渐增大,而G0/G1期细胞百分比降低,且呈浓度依赖性,与对照相比差异均有统计学意义（P＜0.05）,表明细胞被阻滞于G2/M期。4.AOH处理的NIH3T3细胞克隆形成率提高克隆形成实验结果显示,随着AOH浓度的增大,平均克隆率逐渐增高（P＜0.05）,但是50.0μmol/L AOH组克隆形成率降低了。5.AOH诱导NIH3T3细胞中polβ表达增高RT-PCR、免疫细胞化学和Western Blotting结果表明,2.0,10.0,20.0μmol/LAOH作用NIH3T3细胞16 h后,polβ表达增高,具有浓度依赖性。第二章AOH激活NIH3T3细胞中PKA-CREB和p38MAPK-ATF2信号通路方法1.分别用2.0,10.0,20.0μmol/L AOH作用NIH3T3细胞1 h,检测NIH3T3细胞中PKA的活化水平;作用2 h,检测CREB的活化水平。20.0μmol/L AOH作用细胞0,30,60和120 min,检测NIH3T3细胞中PKA和CREB的活化水平。PKA特异性抑制剂H89预处理细胞1 h,再加入20.0μmol/LAOH作用1 h,检测PKA活性变化;作用2 h,检测CREB的活性变化。2.分别用2.0,10.0,20.0μmol/L AOH作用NIH3T3细胞2 h,Western Blotting方法检测细胞中p38和ATF2的磷酸化水平;20.0μmol/L AOH作用细胞0,1,2和4h,检测p38和ATF2的磷酸化水平;利用p38特异性抑制剂SB203580预处理细胞1 h,再加入20.0μmol/L AOH作用2 h,检测p38和ATF2磷酸化水平的变化。3.JNK特异性抑制剂SP600125预处理细胞1 h后,再加入20.0μmol/L AOH作用细胞2 h,同时设20.0μmol/L AOH直接作用组,Western Blotting检测AOH对NIH3T3细胞中JNK1/2的磷酸化作用和对ATF2磷酸化水平的影响。4.p38特异性抑制剂SB203580预处理细胞1 h,再加入20.0μmol/L AOH作用细胞2h,Western Blotting检测细胞中磷酸化CREB表达水平的变化。结果1.AOH激活NIH3T3细胞中PKA-CREB信号通路1.1 AOH诱导PKA激活并发生核转位Western Blotting的结果表明,2.0μmol/L AOH对PKA的活化作用不明显（P＞0.05）,而10.0,20.0μmol/L的AOH能够强烈激活PKA,与对照组相比差异有显著性（P＜0.05）,显示浓度依赖关系。免疫细胞化学法检测结果与之一致。免疫荧光结果表明,PKA活化并转位入核。20.0μmol/L的AOH作用NIH3T3细胞不同时间,Western Blotting的结果表明,随着作用时间的延长,PKA的活化水平逐渐增高,在60 min时达到高峰,显示时间依赖关系。抑制实验的Western Blotting结果显示,H89预处理组活化的PKA的表达水平低于AOH直接处理组（P＜0.05）,免疫细胞化学法和免疫荧光检测结果与之一致。1.2 AOH诱导转录因子CREB激活Western Blotting的结果表明,2.0μmol/L AOH对CREB磷酸化水平增加不明显（P＞0.05）,而10.0,20.0μmol/L的AOH能够强烈激活CREB,与对照组相比差异有显著性（P＜0.05）,显示浓度依赖关系。免疫细胞化学法、免疫荧光检测结果与之一致。20.0μmol/L的AOH作用NIH3T3细胞不同时间,Western Blotting的结果表明,随着作用时间的延长,CREB的磷酸化水平逐渐增高,在2 h达到高峰,显示时间依赖关系。抑制剂H89预处理细胞后,Western Blotting的结果表明,H89部分阻断AOH诱导的CREB的活化,H89预处理组磷酸化CREB的表达水平低于AOH直接处理组（P＜0.05）,免疫细胞化学法和免疫荧光检测结果与之一致。提示AOH处理细胞后,CREB的磷酸化一定程度上依赖于上游PKA的激活。2.AOH激活NIH3T3细胞中p38MAPK-ATF2信号通路2.1 AOH诱导p38MAPK激活Western Blotting的结果表明,2.0,10.0,20.0μmol/L的AOH均能够增加p38的磷酸化水平,与对照组相比差异有显著性（P＜0.05）,并显示浓度依赖关系。20.0μmol/L的AOH作用NIH3T3细胞不同时间,Western Blotting的结果表明,随着作用时间的延长,p38的活化水平逐渐增高（P＜0.05）,在2 h时达到高峰,显示时间依赖关系。用p38特异性抑制剂SB203580预处理细胞,Western Blotting的结果表明,SB203580明显抑制AOH诱导的p38的活化,SB203580预处理组p38的磷酸化水平低于AOH直接处理组（P＜0.05）。2.2 AOH诱导转录因子ATF2激活Western Blotting的结果表明,2.0μmol/LAOH对ATF2磷酸化水平增加不明显（P＞0.05）,而10.0,20.0μmol/L的AOH能够强烈激活ATF2,与对照组相比差异有显著性（P＜0.05）,显示浓度依赖关系。20.0μmol/L的AOH作用NIH3T3细胞不同时间,Western Blotting的结果表明,随着作用时间的延长,ATF2的活化水平逐渐增高（P＜0.05）,在2 h时达到高峰,与p38的磷酸化一致,并显示时间依赖关系。用p38特异性抑制剂SB203580预处理细胞,Western Blotting的结果表明,SB203580明显抑制AOH诱导的ATF2的活化,SB203580预处理组ATF2的磷酸化水平低于AOH直接处理组（P＜0.05）。提示AOH处理细胞后,ATF2的磷酸化依赖于上游p38MAPK的激活。3.JNK通路未被AOH激活JNK是MAPK家族成员之一,介导多种刺激引起的细胞应激反应。WesternBlotting方法检测DNA损伤剂AOH能否激活JNK通路,结果显示,AOH未能增加NIH3T3细胞中的JNK磷酸化水平,JNK抑制剂未能降低AOH对ATF2的激活作用。4.在AOH诱导下,p38MAPK促进CREB的磷酸化Western Blotting结果显示,p38特异性抑制剂SB203580预处理细胞后,结果显示,与AOH激活组相比,SB203580预处理组中磷酸化CREB的水平降低（P＜0.05）。第三章AOH诱导NIH3T3细胞中DNA polβ表达依赖PKA-CREB和p38MAPK-ATF2通路的激活方法1.PKA特异性抑制剂H89预处理NIH3T3细胞1 h,再加入20.0μmol/L AOH作用细胞16 h,免疫细胞化学法和Western Blotting检测polβ的表达,同时设20.0μmol/LAOH直接作用组和溶剂对照组。2.p38特异性抑制剂SB203580预处理细胞1 h,再加入20.0μmol/L AOH作用细胞16 h,Western Blotting检测polβ的表达,同时设20.0μmol/LAOH直接作用组和溶剂对照组。3.H89和SB203580共同预处理细胞1 h,再加入20.0μmol/L AOH作用细胞16 h,Western Blotting检测PKA和p38MAPK双通路阻断对AOH诱导的NIH3T3细胞中polβ表达的影响。4.JNK特异性抑制剂SP600125预处理细胞1 h,再加入20.0μmol/L AOH作用细胞16 h,Western Blotting检测AOH诱导的polβ表达,观察JNK信号通路在DNA polβ基因表达中的作用。结果1.PKA特异性抑制剂H89部分降低AOH诱导的polβ表达为探讨AOH诱导的DNA polβ蛋白表达增加是否通过PKA-CREB信号通路,我们应用PKA特异性抑制剂H89预处理细胞,再用Western Blotting方法检测AOH对DNA polβ蛋白表达的影响。结果显示,H89可以部分抑制AOH诱导的DNA polβ蛋白表达,H89预处理组polβ表达水平低于AOH直接处理组（P＜0.05）。2.p38特异性的抑制剂SB203580部分抑制AOH诱导的polβ表达为探讨AOH诱导的DNA polβ蛋白表达增加是否通过p38-ATF2信号通路,应用p38特异性抑制剂SB203580预处理细胞,再用Western Blotting方法检测AOH对DNA polβ蛋白表达的影响。结果显示,SB203580可以部分抑制AOH诱导的DNApolβ蛋白表达,SB203580预处理组polβ表达水平低于AOH直接处理组（P＜0.05）。3.PKA和p38MAPK双通路阻断明显降低polβ表达Western Blotting结果显示,与单独使用H89和SB203580预处理组相比,H89、SB203580联合作用明显降低AOH诱导的polβ表达（P＜0.05）。4.JNK通路未在NIH3T3细胞中AOH诱导的polβ表达中起作用JNK是MAPK家族成员之一,介导多种刺激引起的细胞应激反应。WesternBlotting方法检测DNA损伤剂AOH能否激活JNK通路参与polβ表达。结果表明,JNK抑制剂未能降低AOH诱导的polβ的表达,提示JNK通路未参与AOH诱导的polβ表达。第二部分PKA-CREB和p38MAPK-ATF2通路激活调节DNA polβ表达在食管癌细胞EC9706中的作用第一章食管癌EC9706细胞中PKA-CREB和p38MAPK-ATF2通路激活调节DNA polβ表达方法1.利用免疫细胞化学和Western Blotting方法检测未处理的食管癌EC9706细胞中PKA催化亚基、CREB的磷酸化状态,同时用PKA特异性的抑制剂H89处理细胞2 h,观察活化的PKA、CREB的改变。2.利用免疫细胞化学和Western Blotting方法检测未处理的食管癌EC9706细胞中p38MAPK、ATF2的磷酸化状态,同时用p38抑制剂SB203580处理细胞2 h,观察活化的p38、ATF2的改变。3.PKA特异性的抑制剂H89和p38抑制剂SB203580单独和联合处理EC9706细胞16 h,利用免疫细胞化学和Western Blotting方法观察DNA polβ表达的变化。4.提取未处理EC9706细胞、H89和SB203580分别处理16 h的EC9706细胞的核蛋白,经凝胶电泳阻滞实验（EMSA）,分析EC9706细胞中活化的CREB、ATF2与DNA polβ启动子中CRE元件的结合活性。结果1.EC9706细胞中PKA-CREB通路处于激活状态Western Blotting与免疫细胞化学结果显示,未处理的EC9706细胞中含有活化的PKA和CREB,H89可以降低其磷酸化水平。2.EC9706细胞中p38-ATF2通路处于激活状态Western Blotting与免疫细胞化学结果显示,未处理的EC9706细胞中含有活化的p38和ATF2,抑制剂SB203580可以降低其磷酸化水平。3.EC9706细胞中激活状态的PKA和p38MAPK通路参与调节DNA polβ的表达为证实EC9706细胞中PKA、p38MAPK通路的激活与DNA polβ的表达存在一定的关系,我们采用阻断信号通路的方法,分别单独和联合使用PKA抑制剂H89和p38抑制剂SB203580作用EC9706细胞16 h,观察DNA polβ的表达的变化。免疫细胞化学和免疫印迹实验结果显示,未处理的EC9706细胞中有一定水平的DNA polβ的表达,H89和SB203580可以部分降低细胞中polβ的表达,两者联合使用,polβ的表达降低更明显。EMSA结果显示,EC9706细胞中活化的CREB、ATF2与polβ启动子中的CRE元件有较强的结合活性。第二章阻断DNA polβ表达的信号通路对食管癌EC9706细胞生物学特性和对顺铂敏感性的影响方法1.PKA特异性抑制剂H89和p38MAPK特异性抑制剂SB203580单独和联合处理EC9706细胞24 h,用倒置显微镜观察细胞形态学变化;用Annexin V-FITC和PI双染色,流式细胞仪检测细胞凋亡率;水溶性四氮唑（WST-8）测定抑制剂作用24和48 h细胞增殖改变。2.在EC9706细胞中加入H89和SB203580单独和联合预处理1 h,再加入顺铂培养24 h,用倒置显微镜观察细胞形态学变化;用Annexin V-FITC和PI双染色,流式细胞仪检测细胞凋亡率;WST-8测定抑制剂作用24和48 h细胞增殖改变。结果1.阻断PKA和p38信号通路、降低DNA polβ表达对食管癌EC9706细胞生物学特性的影响H89和SB203580单独作用EC9706细胞,部分细胞出现细胞形态缩小,细胞增殖减慢;当H89和SB203580联合作用,EC9706细胞出现细胞形态缩小,胞质凝缩,细胞漂浮数明显增加,细胞数量下降,增殖受到抑制。细胞增殖实验结果显示,与对照组相比,H89组和SB203580组细胞的24 h、48 h存活率均下降（P＜0.05）,当H89与SB203580共同作用于细胞时,细胞存活率进一步下降（P＜0.05）。Annexin V-FITC和PI双染色,细胞凋亡检测结果显示,EC9706在H89和SB203580单独作用24 h,均表现为促进细胞凋亡;当H89和SB203580联合使用时,促进细胞凋亡和坏死作用更加显著。2.阻断PKA和p38信号通路、降低DNA polβ表达增加食管癌EC9706细胞对顺铂的敏感性化疗药顺铂单独作用EC9706细胞,出现细胞形态缩小,漂浮细胞数量增加,细胞增殖较慢;当H89和SB203580分别与顺铂联合作用,EC9706细胞出现细胞形态缩小,胞质凝缩,细胞漂浮数明显增加,细胞数量下降,增殖明显受到抑制,而H89、SB203580共同联合顺铂使用时,这种变化尤为明显。细胞增殖实验结果显示,与单用顺铂相比,当H89或SB203580与顺铂联合作用于细胞时,细胞存活率下降,细胞的增殖受到抑制（P＜0.05）,增加了对顺铂的化疗敏感性;当三者联合,抑制更明显。细胞凋亡检测结果显示,与单独使用顺铂的对照组相比,当H89或SB203580联合顺铂使用时,细胞总凋亡率增加（P＜0.05）;尤其是H89、SB203580和顺铂三者联合时更明显。结论1.一定浓度的AOH能够产生抑制细胞增殖、引起细胞周期阻滞、造成DNA损伤等急性反应和和克隆形成率增加,并能够诱导DNA polβ表达增高。2.AOH诱导NIH3T3细胞中的PKA-CREB信号通路和p38MAPK-ATF2信号通路激活,上调DNA polβ基因表达。3.在食管癌细胞EC9706中PKA-CREB信号通路和p38MAPK-ATF2信号通路处于激活状态,两者共同促进DNA polβ的表达。4.阻断PKA和p38MAPK信号途径,降低DNA polβ表达,改变EC9706细胞生物学特性,增加对化疗药顺铂的敏感性,有可能成为食管癌治疗的辅助治疗方法。
论文目录
相关论文文献
- [1].DNA pol β,Ku80与鼻咽癌放射敏感性的关系[J]. 武汉大学学报(医学版) 2010(04)
- [2].DNA polβ基因对乳癌细胞MCF-7增殖及侵袭影响[J]. 青岛大学学报(医学版) 2019(06)
- [3].尖毛虫属Actin Ⅰ、α-TBP和DNA pol α乱序基因的模式研究[J]. 水生生物学报 2017(02)
标签：聚合酶论文; 互隔交链孢酚论文; 信号转导论文; 激活论文; 磷酸化论文; 细胞论文; 顺铂论文; 化疗敏感性论文;