论文摘要
脂肪组织具有内分泌功能是近几年内分泌学科领域取得的突破性进展之一。研究表明，脂肪组织不仅是能量储存器官，而且是控制能量平衡的内分泌器官，当机体代谢状态改变或受外来刺激时脂肪组织可分泌多种具有生理活性的物质，即脂肪细胞因子，包括瘦素、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、抵抗素、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）和脂联素（adiponectin，ADPN）等。脂联素作为脂肪细胞因子之一，具有重要的生理功能：改善糖脂代谢及胰岛素抵抗；通过抑制血管细胞粘附分子及细胞间粘附分子等在人类主动脉内皮细胞表面的表达，起到抗动脉粥样硬化的作用；可使肥胖者体重减轻；通过抑制巨噬细胞前体细胞的生成和成熟巨噬细胞的功能调节炎症反应。因此脂联素与胰岛素抵抗、2型糖尿病、肥胖以及心血管疾病的发生发展有着密切联系。目前，已有一些研究者应用多种蛋白表达系统表达重组脂联素。原核表达系统虽然成本低，但是外源蛋白存在于包涵体中，且易形成二聚体，所以纯化过程相当繁复。同时，原核细胞不具有高等真核细胞中的多种蛋白转录后修饰加工体系，所以生物制药领域真核表达系统是发展的方向。不过，哺乳动物表达系统成本过高，限制了它的应用。昆虫杆状病毒表达系统是一种广泛应用的外源蛋白表达系统。它利用杆状病毒多角体蛋白的强启动子，蛋白产量高；它又是一种真核表达系统，具有蛋白质的修饰、加工和转运体系，重组蛋白具有较好的生物活性和免疫原性；杆状病毒只感染节肢动物，生物安全性好。因此，我们选用该表达系统进行重组脂联素蛋白的表达。研究目的：1．克隆人脂联素目的基因，构建其昆虫杆状病毒系统表达载体。2．转染培养的Sf9昆虫细胞系，获得重组杆状病毒感染Sf9细胞进行重组蛋白的表达，鉴定表达产物。实验方法：1．从人的脂肪组织中提取总RNA，利用RT-PCR的方法得到人脂联素基因cDNA序列，构建模板质粒，自行设计引物一对，经PCR扩增人脂联素基因完全编码序列并使两端加上酶切位点及组氨酸纯化标签，构建pMD18-T／ADPN重组克隆载体，目的序列测序鉴定；pMD18-T／ADPN与转移载体pFastBac1经限制性内切酶BamHI、EcoRI双酶切后经T4DNA连接酶连接构建重组转移载体pFastBac-ADPN。2．将pFastBac-ADPN转化入含有穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，筛选可能含有阳性克隆的白色菌落进行鉴定，提取阳性克隆中的重组Bacmid，命名为Bacmid-ADPN。3．将Bacmid—ADPN转染培养的Sf9昆虫细胞，获得原代重组杆状病毒后扩增并感染Sf9细胞，收获的细胞裂解液及细胞培养上清经SDS-PAGE、Western blot鉴定其中的表达产物。4．通过改变M．O．I和表达时间摸索最佳表达条件，进行重组蛋白的表达。实验结果：1．成功构建重组转移载体，ADPN目的基因插入位置正确。2．重组穿梭载体Bacmid—ADPN转染Sf9细胞，获得的重组杆状病毒PCR鉴定结果可见771bp目的条带，表明ADPN基因已经成功重组到杆状病毒基因组中。3．在细胞培养上清中检测到表达产物，表明重组蛋白利用自身信号肽获得分泌性表达。细胞裂解液和细胞培养上清中表达的重组蛋白分子量约为30kD，具有人脂联素抗原性。实验结论：上述结果表明成功构建了表达人脂联素的重组杆状病毒载体并在昆虫细胞中得到可溶性分泌性表达。昆虫杆状病毒表达系统是一个高效、快速表达重组脂联素蛋白的良好选择。
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相关论文文献
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