超嗜热古菌真核同源的Orc1/Cdc6蛋白与复制原点之间的相互作用研究

论文摘要

极端嗜热古菌硫磺矿硫化叶菌（Sulfolobus solfataricus P2）含有三个有活性的复制原点和三个真核类似的Orc1/Cdc6蛋白（命名为SsoCdc6-1,SsoCdc6-2和SsoCdc6-3）,因此成为研究真核生物复杂DNA复制机制的理想材料。但是目前还不清楚古菌的这种多个Orc1/Cdc6蛋白之间能否通过功能性的相互作用共同来调控DNA复制起始。本研究采用纯化的复制起始蛋白SsoCdc6及其突变体,在体外比较研究了它们与两个复制原点DNA之间的相互作用,特别是首次对古菌的多个SsoCdc6蛋白相互调控它们与原点DNA的相互作用进行了系统的生化分析。本研究主要取得了以下几个方面的结果:1.构建了SsoCdc6-2蛋白和SsoCdc6-2的C-末端缺失体（SsoCdc6-2△C）的大肠杆菌表达菌株,并通过热处理和Ni-NTA镍琼脂糖凝胶亲和纯化等步骤获得纯度达99%以上的SsoCdc6蛋白和SsoCdc6△C蛋白;针对S.solfataricus复制原点oriC1和oriC2的结构特征,设计了分别包括分叉和平端两种结构的三组特异性DNA底物。这些底物的共同特征是含有相互重叠的SsoCdc6结合位点。2.通过一系列电泳迁移率改变实验（EMSA）,发现SsoCdc6-1能够刺激SsoCdc6-2和SsoCdc6-3的DNA结合活性;相反,SsoCdc6-3抑制SsoCdc6-1与DNA底物的结合。而且它们的C-末端缺失体（ssoCdc6△C）基本保留了这种类似的调控功能。因此,三个SsoCdc6蛋白能够相互调控（正调控或者负调控）各自对原点特异性DNA的结合。3.采用Pull-down/Western blot分析,发现了如下几组蛋白间物理性的相互作用:SsoCdc6-1/SsoCdc6-3,SsoCdc6-1△C/SsoCdc6-3,SsoCdc6-1/SsoCdc6-2,SsoCdc6-1△C/SsoCdc6-2,SsoCdc6-2/SsoCdc6-3,SsoCdc6-2/SsoCdc6-3△C。另外,采用细菌双杂交技术,检测到了三个SsoCdc6蛋白与另一个复制起始蛋白SsoMCM均能发生物理的相互作用。4.构建了SsoCdc6-2蛋白Walker A模体的定点突变体（SsoCdc6-2KA）的大肠杆菌表达菌株,通过优化表达条件获得了重组蛋白。进一步的EMSA实验表明,SsoCdc6-2KA保留了结合DNA的特性但失去了自磷酸化的功能。DNA复制过程是个十分复杂的过程,它需要蛋白质-蛋白质之间和蛋白质-DNA之间高度协调性的相互作用。极端嗜热古菌S.solfataricus的DNA复制机制是目前研究的热点和前沿,本研究首次系统阐明的古菌多个复制起始蛋白Orc1/Cdc6之间功能性的相互作用机制等研究成果,不仅对于我们深入理解这种古老微生物本身的DNA复制及遗传规律奠定了基础,同时也为最终阐明真核生物复杂的DNA复制调控机制提供了重要线索。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 古菌
• 1.1.1 三域学说
• 1.1.2 古菌域的界和古菌多样性
• 1.1.3 古菌的细胞结构
• 1.1.4 古菌的基因组
• 1.1.5 古菌的转录
• 1.1.6 古菌的翻译
• 1.2 极端嗜热古菌和硫化叶菌
• 1.2.1 嗜热特性
• 1.2.2 硫化叶菌
• 1.3 古菌DNA复制概述
• 1.3.1 复制原点
• 1.3.2 起始阶段
• 1.3.3 延伸阶段
• 1.3.4 古菌染色质
• 1.4 研究目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 PCR引物
• 2.1.3 电泳迁移率改变实验（EMSA）用的DNA寡核苷酸链
• 2.1.4 培养基、抗生素及培养温度
• 2.1.5 试剂
• 2.1.6 抽提液和缓冲液
• 2.1.7 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 核酸操作方法
• 2.2.2 大肠杆菌感受态制备及常规转化
• 2.2.3 蛋白质SDS-PAGE
• 2.2.4 Ssocdc6、Ssocdc6△C和Ssomcm基因的克隆、表达和纯化
• 2.2.5 DNA底物的同位素标记
• 2.2.6 电泳迁移率改变实验（EMSA）
• 2.2.7 Pull-down实验
• 2.2.8 抗体的制备和Western blot实验
• 2.2.9 细菌双杂交实验
• 2.2.10 体外自磷酸化实验
• 3 结果与分析
• 3.1 SsoCdc6-2、SsoCdc6-2△C和SsoMCM的基因克隆、原核表达和纯化
• 3.1.1 SsoCdc6-2、SsoCdc6-2△C和SsoMCM原核表达载体的构建
• 3.1.2 SsoCdc6-2、SsoCdc6-2△C和SsoMCM的表达和纯化
• 3.1.3 小结
• 3.2 EMSA实验中DNA底物的设计
• 3.3 EMSA实验结果
• 3.3.1 SsoCdc6-1和SsoCdc6-2与DNA底物D1的结合
• 3.3.2 SsoCdc6-2和SsoCdc6-3与DNA底物D2的结合
• 3.3.3 SsoCdc6-1和SsoCdc6-3与DNA底物D3的结合
• 3.3.4 SsoCdc6三个起始蛋白相互调控各自对DNA底物D3的结合
• 3.3.5 小结
• 3.4 三个SsoCdc6复制起始蛋白两两之间的物理相互作用
• 3.4.1 无标签（untagged）SsoCdc6蛋白的表达和纯化
• 3.4.2 三个SsoCdc6蛋白两两之间的物理相互作用
• 3.4.3 小结
• 3.5 起始蛋白SsoCdc6与解旋酶SsoMCM之间的相互作用
• 3.5.1 双杂交重组质粒pBTCdc6-2、pBTMCM和pTRGMCM的构建
• 3.5.2 SsoCdc6与SsoMCM之间的相互作用
• 3.5.3 小结
• 3.6 SsoCdc6-2突变体SsoCdc6-2KA基本生化性质的研究
• 3.6.1 SsoCdc6-2KA原核表达载体pET15bCdc6-2KA的构建
• 3.6.2 SsoCdc6-2KA的表达和纯化
• 3.6.3 SsoCdc6-2KA蛋白基本生化性质的研究
• 3.6.4 小结
• 4 总结与讨论
• 4.1 总结
• 4.2 古菌复制起始蛋白Orc1/Cdc6与原点DNA相互作用的特点
• 4.3 细菌DnaA蛋白与原点DNA相互作用的特点及其与古菌的比较
• 4.4 对古菌Cdc6蛋白与原点oriC相互作用的研究为真核生物的研 究提供了线索
• 4.5 S.solfataricus第三个复制原点oriC3与先发现的两个原点oric1和 oriC2的比较
• 4.6 下一步工作设想
• 参考文献
• 致谢
• 附录