新型非病毒基因转染体系的构建及其在骨髓间充质干细胞基因重组中的应用

论文摘要

目的：为提高非病毒载体转染细胞后的基因表达水平并延长表达时间,并为骨髓间充质干细胞（MSC）生长创造更好的环境,以期用于软骨损伤的体内再生治疗。方法：1、合成普鲁兰糖-精胺,与DNA孵育制备普鲁兰糖-精胺/DNA复合物,考察该复合物的粒径与电位。2、考察基因复合物在不同细胞上的转染效果,利用阴离子化明胶构建反向转染体系,比较反向转染方法与常规转染方法的差异3、在体外选择PET无纺纤维与胶原海绵作为支架,结合反向转染构建了反向三维转染体系,在MSC上考察报告基因转染效果与转染编码TGFβ-1的DNA后诱导MSC向软骨方向分化的能力。4、以可降解的壳聚糖温敏凝胶与明胶海绵作为三维支架,携载以普鲁兰糖-精胺转染TGFβ-1基因的MSC,考察其软骨修复的能力。结果：普鲁兰糖-精胺/DNA复合物可以成功转染MSC。在血清存在情况下,反向转染方法相比常规方法可以产生更高的基因表达。阴离子化明胶的带电性与反向转染体系的转染效率密切相关,所带负电荷的多少可以影响到基因复合物的释放过程,以及血清蛋白在表面上的吸附量。不同的转染方法可能影响到细胞对基因复合物的摄取途径,摄取的改变与载体类别和细胞类型都有关系。培养在三维支架上的MSC转染后相比二维环境下可以保持更长期的基因表达,在PET无纺纤维上的基因表达水平也更高。以壳聚糖温敏凝胶为支架携载转染pTGFβ-1的MSC治疗组与未处理损伤组修复效果相似；以含有TGFβ-1基因的明胶海绵或经过TGFβ-1基因重组的MSC进行修复,具有一定的软骨修复效果。结论：血清的加入对反向转染体系的基因转染效果不产生明显影响,克服了常规转染时血清对转染效率的负面影响。将反向转染与三维支架结合后更有利于细胞的生长,使MSC在体外保持长期的基因表达。以明胶海绵携载转染pTGFβ-1后的MSC体内移植后可促进大鼠膝关节软骨损伤修复。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 序论
• 第1章 常规基因转染与反向基因转染的比较研究
• 1.1 仪器与试剂
• 1.1.1 仪器
• 1.1.2 试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 普鲁兰糖-精胺的合成
• 1.2.2 质粒DNA的扩增
• 1.2.3 普鲁兰糖-精胺/DNA复合物的制备
• 1.2.4 复合物的粒径与Zeta电位测定
• 1.2.5 细胞培养与鉴定
• 1.2.6 常规转染
• 1.2.7 阴离子化明胶合成
• 1.2.8 阴离子化明胶取代度与Zeta电位测定
• 1.2.9 反向转染
• 1.2.10 反向转染体系表征
• 1.2.11 反向转染效果影响因素
• 1.2.12 普鲁兰糖-精胺/DNA复合物细胞毒性检测
• 1.2.13 普鲁兰糖-精胺/DNA复合物入胞机制考察
• 1.3 实验结果与讨论
• 1.3.1 普鲁兰糖-精胺表征
• 1.3.2 粒径及电位测定
• 1.3.3 MSC鉴定
• 1.3.4 常规转染与反向转染对比
• 1.3.5 阴离子化明胶的表征
• 1.3.6 反向转染效果影响因素
• 1.3.7 反向转染中的基因释放
• 1.3.8 反向转染中的血清蛋白排斥
• 1.3.9 普鲁兰糖-精胺/DNA纳米粒细胞毒性
• 1.3.10 普鲁兰糖-精胺/DNA复合物入机制
• 1.4 小结
• 第2章 细胞支架的表征及三维转染体系的体外评价
• 2.1 仪器与试剂
• 2.1.1 仪器
• 2.1.2 试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 三维转染
• 2.2.2 三维转染体系形态观察
• 2.2.3 三维转染体系中TGF-β1表达
• 2.2.4 组织染色
• 2.2.5 壳聚糖温敏凝胶的制备
• 2.2.6 壳聚糖温敏凝胶的表征
• 2.2.7 明胶海绵的制备
• 2.2.8 明胶海绵的表征
• 2.3 实验结果与讨论
• 2.3.1 三维转染体系形态
• 2.3.2 三维转染效果
• 2.3.3 细胞在三维支架上生长状况
• 2.3.4 组织染色
• 2.3.5 β-甘油磷酸钠浓度对壳聚糖温敏凝胶化时间的影响
• 2.3.6 明胶海绵的表征
• 2.4 小结
• 第3章 携载治疗基因的MSC的体内软骨缺损修复效果评价
• 3.1 仪器与试剂
• 3.1.1 仪器
• 3.1.2 试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 软骨缺损模型构建
• 3.2.2 携载TGF-β1基因的MSC大鼠软骨缺损治疗实验
• 3.2.3 软骨损伤修复效果评价
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 整体动物观察
• 3.3.2 软骨损伤面大举观察
• 3.3.3 组织染色
• 3.3.4 GAG含量测定
• 3.4 小结
• 全文小结
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 作者简介
• 攻读期成果