论文摘要
研究背景与目的未分级肝素（UFH）和低分子量肝素（LMWH）通过激活生理性的凝血抑制剂抗凝血酶在抗凝血方面发挥重要作用。抗凝血酶能够抵消参与凝血的许多丝氨酸蛋白酶尤其是凝血因子X和凝血酶的作用。除了抗凝作用外，UFH和LMWH还具有广泛的其他生物学活性。UFH和LMWH在肿瘤治疗方面的积极作用已被证实。MALT（malignancy and low-molecular-weight heparin therapy）是在没有合併静脉血栓的进展期肿瘤患者上进行的关于肝素的临床试验，该试验的结果表明使用LMWH可以延长患者的生存期。FAMOUS（The fragmin advanced malignancy outcome study）的研究结果与MALT基本一致。另外，临床观察发现，LMWH能够增强化疗药物的抗肿瘤作用。大量的资料表明，肝素及其衍生物在肿瘤治疗上表现出的良好作用不只与其抗凝作用有关。目前已经发现的UFH和LMWH影响肿瘤生长和转移的可能机制包括：1．UFH和LMWH影响肿瘤血管形成；2．UFH和LMWH影响选择素与选择素配体的结合；3．UFH和LMWH影响机体免疫；4．UFH和LMWH能抑制降解基底膜的肝素酶的活性；5．UFH和LMWH能调节多种肝素结合生长因子和整合素的功能。UFH和LMWH对一些细胞的生长有直接的抑制作用。不论在体内还是在体外，UFH和LMWH都能降低血管平滑肌细胞的有丝分裂活动。气道和肠道的平滑肌细胞以及肾实质细胞对UFH和LMWH也有同样的反应。UFH还能够诱导来自于急性淋巴母细胞性白血病患者的淋巴母细胞、中性粒细胞和单核细胞凋亡。然而，在肺腺癌细胞上进行的有关UFH和LMWH研究却很少，目前还不明确UFH和LMWH是否对A549肺腺癌细胞有直接的生长和增殖抑制作用。细胞和组织的稳定状态严格依赖于信号途径网的协调性调节，这种调节使得细胞和组织在增殖与生长阻滞、分化与静止、生存与凋亡之间保持动态的平衡。任何方面的过分的调节都可能导致肿瘤的产生和进展。一些细胞生长的负性调节因子的失活或活性下降与肿瘤的产生和发展有关，也在一定程度上导致了肿瘤细胞的高侵袭性和高增殖性。细胞周期的进展受许多因子的控制，这些因子主要包括周期素（cyclin）、周期素依赖性激酶（cyclin-dependent-kinase，CDK）和周期素依赖性激酶的抑制剂（CDK-inhibitor，CDKI）。CDKI是细胞周期的负调节因子，能抑制CDK-cyclin复合体的活性，将细胞抑制在某个时期。目前发现的CDKI有两个家族，KIP家族和INK4家族。KIP家族包括p21WAF1、p27KIP1和p57KIP2三个成员；INK4家族包括p16INK4a、p15INK4b、p18INK4c和p19INK4d四个成员。KIP家族能结合大多数的与G1／S转变有关的CDK-Cyclin复合体并抑制其活性。INK4家族特异性与CDK4和CDK6结合而抑制其活性。在细胞周期调节中有一个限制点（restriction point，R）和两个控制点（checkpoint）对正常细胞周期的运行具有重要的调控作用。R点位于G1时相的中间区。两个控制点一个是G1／S控制点，控制G1期进入S期，另一个是G2/M控制点，控制G2期进入M期。G1／S控制点是细胞增殖过程中主要的一个控制点，受p21WAF1多层次的调节。在没有生长因子和其他有丝分裂原刺激的情况下，细胞完成有丝分裂后将停滞在G0期，G0期是G1期的早期的可逆阶段。处于G0期的细胞在持续的有丝分裂原刺激下产生cyclinD，cyclinD与CDK4或CDK6形成CDK4／CDK6-cyclin D复合体，经磷酸化修饰呈丝／苏氨酸蛋白激酶活性，在G1中期达到高峰，促使细胞越过R点进入G1后期。在G1晚期还出现CDK2／cyclin E复合体蛋白激酶。由CDK2／cyclin E复合体和CDK4／CDK6-cyclin D复合体这两种激酶磷酸化pRb，释放转录因子E2F，促进与DNA复制有关的基因表达，为DNA复制准备条件。CDK2／cyclin E复合体蛋白激酶在G1晚期达到高峰，促使细胞越过G1／S控制点而进入S期。细胞在越过G1／S控制点进入S期后，细胞的分裂不再需要有丝分裂原的刺激，主要由CDK2／cyclin A复合体参与DNA复制的进行。在G2期，CDK1先后与cyclin A和B结合形成CDK1-cyclin A和CDK1-cyclin B复合体，但由于cyclin A在经过S期后含量降低，故在G2期内主要由CDK1-cyclin B复合体呈现功能，促使细胞越过G2／S控制点。p21WAF1和p27KIP1在肿瘤的形成和发展中都起了重要作用。在许多肿瘤，包括肺癌，p21WAF1和p27KIP1的表达降低。降低了的p21WAF1和p27KIP1表达造成细胞生长与死亡的平衡失调，导致肿瘤的产生和进展。一些药物通过提高p21WAF1和p27KIP1表达水平来抑制肿瘤生长。目前还不明确UFH或LMWH是否能通过p21WAF1和p27KIP1对A549细胞发挥其抑制生长的作用。材料和方法在此项研究中，我们用达肝素钠干预体外培养的肺腺癌A549细胞系，观察某些与细胞生物学特性有关的指标的变化。首先，依据相关文献，用五种不同浓度（0IU／mL，2IU／mL，10IU／mL，50IU／mL，100IU／mL和500IU／mL）的达肝素钠干预A549细胞的生长，用MTT方法在四个时间点（6h，12h，24h和36h）检测细胞活性，并确定用于随后研究的最佳药物浓度。为观察达肝素钠对A549细胞周期进展的影响，将经过24h普通培养的A549细胞继续在含有50IU／mL达肝素钠的培养液中培育，以正常培育的细胞作为对照组，将两组细胞24h后以PI染液染色，用流式细胞仪检测并分析细胞周期的分布。为了解达肝素钠对A549细胞凋亡状态的影响，用上述方法培育细胞，24h后收集各组细胞，以AnnexinV-FITC和PI双染所收集的细胞，流式细胞仪检测早期凋亡细胞的比率并分析数据，将数据与对照组比较。为明确达肝素钠是否通过p21WAF1和p27KIP1这两种重要的细胞周期和凋亡调节蛋白发挥作用，我们通过western blotting法和RT-PCR法分别检测了p21WAF1和p27KIP1蛋白和mRNA的水平，以各组的内参作组内平衡，以正常培育的A549细胞为对照组。为进一步阐明p21WAF1和p27KIP1在达肝素钠对A549细胞的凋亡诱导和细胞周期抑制中的作用，我们首先用特异性的siRNA分别沉默p21WAF1和p27KIP1基因的表达，以转染随机序列siRNA的细胞为对照组，并以western blotting法证实各自的沉默效果，在24h后按前述方法检测细胞周期的分布和凋亡分布情况。数据用SPSS 11．0软件进行t-检验或ANOVA分析，显著性检验水平为P<0．01或0．05。结果1．达肝素钠降低A549细胞活性，而且这种作用表现出时间依赖性和浓度依赖性。50IU／mL达肝素钠在干预细胞生长24h后能抑制大约50％的细胞活性。2．流式细胞分析显示达肝素钠抑制细胞周期的进展。与对照组相比，试验组细胞在G1期比率显著增加（P<0．05），在S期比率明显降低（P<0．05）。处于G2／M期的细胞比率虽有增加，但这种差异与对照组比没有统计学意义（P>0．05）。3．与对照组相比，50IU／mL达肝素钠培育的A549细胞早期凋亡比率高于对照组（P<0．05）。另外，达肝素钠不增加死亡细胞的比率。4．达肝素钠提高p21WAF1和p27KIP1蛋白的水平，但对p21WAF1和p27KIP1mRNA水平没有明显影响。5．用靶向性的siRNA沉默p21WAF1基因后达肝素钠对A549细胞的周期抑制和凋亡诱导作用明显减弱（P<0．05）；对p27KIP1基因沉默后得到类似的结果。结论和意义1．达肝素钠能降低A549细胞活性。2．A549细胞活性的降低是由达肝素钠对细胞周期的抑制和凋亡的诱导作用导致的。3．A549细胞表达低到中等水平的p21WAF1和p27KIP1蛋白。4．p21WAF1和p27KIP1蛋白至少部分参与了达肝素钠的对A549细胞周期阻滞和凋亡诱导过程。5．达肝素钠引起的A549细胞p21WAF1和p27KIP1蛋白的改变发生在转录后水平。6．发生在转录后水平的p21WAF1和p27KIP1蛋白的改变最终导致了A549细胞在细胞周期进展、凋亡状态和细胞活性方面的变化。7．该课题的研究结果从另外一个角度解释了低分子肝素的抗肿瘤作用机理，为以后的研究提供了新的思路与方向，也为临床药物应用提供新的理论依据。