浙江余杭中华鳖暴发性疾病主要病原及诊断技术研究

论文摘要

中华鳖养殖业是我国水产养殖业的重要组成部分,也是水产养殖业中经济效益较高的养殖种类。但随着中华鳖养殖规模不断扩大,各种病害也日趋增多,暴发性传染病更是引起人们的关注。2006年5—7月,杭州市余杭区某中华鳖养殖场生态鳖养殖池出现中华鳖急性发病并出现大量死亡,死亡中华鳖脖子肿大,底板发白,咽喉腮状组织群毛突起、充血糜烂,胃肠粘膜严重充血,脾脏紫黑色,肝脏肿大呈花斑状。作者对发病中华鳖进行了细菌分离和病毒病原研究:从发病中华鳖肝脏、脾脏、肾脏分离到气单胞菌等细菌,对正常中华鳖进行感染试验,以1×108cfu/ind攻毒不能使中华鳖发病;取典型症状的发病中华鳖内脏匀浆上清除菌过滤后,以1:50-1:5000稀释后以0.5mL/ind肌肉注射健康中华鳖,5d后陆续发病死亡,死亡中华鳖出现脖子肿大、咽喉及胃肠粘膜严重充血、脾脏紫黑色、肝脏肿大呈花斑状等自然发病中华鳖相似症状;取人工感染发病中华鳖组织匀浆除菌后继续感染健康中华鳖,已成功在健康中华鳖中重复感染5代,均可复制出相同症状,人工感染发病鳖内脏中未分离到细菌;取发病中华鳖组织经2.5%戊二醛固定、磷钨酸染色后超薄切片电镜观察,从肠组织中发现大量的球状病毒,病毒颗粒大小为127±4nm。为进一步研究病毒特性,作者以中华鳖肾组织、胚胎为材料,用组织块培养法进行原代肾细胞和胚胎细胞培养,采用15%胎牛血清及12%新生牛血清的DMEM培养基分别用于原代培养和传代细胞培养,建立了中华鳖肾细胞株PsK-0612和胚胎细胞株PsE-0612。目前两个建株细胞分别传代80余代及70余代,均为上皮样细胞,生长和传代稳定;传代细胞冻存后,复苏状态良好,最适培养温度为28-30℃。对两个建株细胞的生长指数、分裂指数进行了测定,绘制了生长曲线和分裂指数曲线,结果PsK-0612与PsE-0612的生长呈缓慢-快速-稳定的趋势;分裂指数分别于接种后第4天和第2天达到高峰;分别对50个第49代分裂中期PsK-0612细胞和第37代分裂中期PsE-0612细胞进行分析表明,PsK-0612与PsE-0612染色体数目为2n=66±2。将典型症状发病中华鳖组织匀浆滤液接种作者建立的中华鳖肾细胞株PsK-0612和胚胎细胞株PsE-0612;其中,接种后的PsK-0612在30℃培养4—6d后可出现细胞病变,表现为细胞颗粒明显增多、出现大量空洞,随后大量脱落,对照细胞培养相同时间后未见明显病变;用第4代出现病变细胞的悬液以0.5mL/ind注射健康中华鳖,对照为第4代出现病变细胞的悬液在56℃灭活30 min,6d后,中华鳖发病死亡,对照中华鳖未发病:PsE-0612未出现明显的病变。病毒分类有关工作还在进行中。从中华鳖中分离的嗜水气单胞菌致病株T0608,该菌株毒力较强,是重要的继发病原。取T0608福尔马林灭活菌体注射免疫新西兰兔,制备了高价免疫血清,血清的菌体凝集效价可达1/1 280;用G蛋白亲和层析纯化兔IgG,将IgG用生物素标记,建立了生物素—亲和素双抗体夹心酶联免疫吸附法（BA-ELISA）;该法的最低检出限为2.5×103 cfu,相当于0.5 ng菌体蛋白,其检测灵敏度为ABC-ELISA（4.0×104cfu）和间接ELISA（4.0×104cfu）的16倍;本法对鱼类气单胞菌、拟态弧菌、海豚链球菌、大肠杆菌等无交叉反应,有良好的特异性。用BA-ELISA法对湖州市龟鳖养殖场的水样、中华鳖和巴西龟肝、肠道内容物进行检测,结果表明本法可用于直接检测发病中华鳖肝、肠中的嗜水气单胞菌,可较好应用于发病中华鳖的病原早期快速诊断及养殖中华鳖的病原检测。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 文献综述
• 1.1 中华鳖养殖与产业概况
• 1.2 中华鳖的主要疾病
• 1.2.1 细菌性疾病
• 1.2.2 真菌性疾病
• 1.2.3 寄生虫性疾病
• 1.2.4 非生物性疾病
• 1.2.5 原因不明性疾病
• 1.3 中华鳖病毒病的研究现状
• 1.4 水产动物组织体外培养技术的研究概况
• 1.4.1 动物组织培养（细胞培养）概况
• 1.4.2 水产动物组织培养（细胞培养）概况
• 1.5 研究目的和意义
• 2 中华鳖暴发性疾病主要病原的初步研究
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 实验主要试剂
• 2.1.3 细菌的分离
• 2.1.4 病毒悬液的制备
• 2.1.5 感染试验
• 2.1.6 病鳖的超薄切片和电镜观察
• 2.2 结果
• 2.2.1 细菌的分离及人工感染试验
• 2.2.2 病毒悬液的人工感染试验
• 2.2.3 病毒的超薄切片观察
• 2.3 讨论
• 3 中华鳖肾细胞株及胚胎细胞株的建立及初步应用
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料来源
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 原代细胞和传代细胞培养
• 3.1.4 细胞形态
• 3.1.5 细胞生长曲线的测定
• 3.1.6 细胞分裂指数的测定
• 3.1.7 细胞低温冻存及复苏培养
• 3.1.8 染色体分析
• 3.1.9 病毒悬液的制备
• 3.1.10 中华鳖肾细胞和胚胎细胞对病毒悬液的敏感性
• 3.2 结果
• 3.2.1 中华鳖细胞建系过程
• 3.2.2 细胞形态
• 3.2.3 细胞系的生长曲线
• 3.2.4 细胞的分裂指数
• 3.2.5 染色体数目
• 3.2.6 复苏情况
• 3.2.7 中华鳖细胞系对病毒悬液的敏感性
• 3.3 讨论
• 4 嗜水气单胞菌BA-ELISA的建立及在病原检测中的应用
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌株及试验动物
• 4.1.2 试剂和仪器
• 4.1.3 抗原的制备
• 4.1.4 兔抗血清的制备
• 4.1.5 抗体的提纯及生物素标记
• 4.1.6 BA-ELISA的建立
• 4.1.7 BA-ELISA灵敏度和特异性
• 4.1.8 生物素抗体及Avi-HRP的孵育时间
• 4.1.9 人工感染中华鳖的病原检测
• 4.1.10 龟鳖养殖池样品的病原检测
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 抗血清的效价
• 4.2.2 包被抗体及生物素标记抗体工作浓度的选择
• 4.2.3 BA-ELISA的灵敏度
• 4.2.4 BA-ELISA的特异性
• 4.2.5 生物素抗体及Avi-HRP的孵育时间
• 4.2.6 人工感染中华鳖的病原检测
• 4.2.7 龟鳖养殖池样品的病原检测
• 4.3 讨论
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间成果
• 致谢