农杆菌介导GmWRKY21基因转化大豆的研究

论文摘要

大豆营养丰富,蛋白与脂肪含量较高,是国际贸易中居于重要地位的经济作物。发展大豆产业对解决我国大豆紧缺、满足国内不断增长的大豆消费需求具有十分重要的意义。传统常规育种具有选择效率低、育种周期长等缺点。相比之下,植物转基因技术以其在改善大豆品质、增强耐逆性、提高产量等方面具有定向改良、简便高效、周期较短等优势,为大豆育种技术的发展和提升开辟了新途径。本项实验分别以子叶节、带一片子叶的胚尖作为外植体,通过农杆菌介导法将耐冷相关转录因子基因GmWRKY21导入大豆,以期获得耐冷性明显提高的大豆新种质。取得如下主要研究成果：1、利用子叶节受体系统进行的大豆遗传转化实验,主要对18个大豆基因型进行了筛选比较并测定了恢复培养阶段GA3浓度对丛生芽诱导分化的影响。结果显示,大豆丛生芽诱导率在不同基因型之间存在显著性差异,较适于大豆组织培养体系的基因型主要包括‘浙春3号’、‘H0301’、‘油02-32’、‘吉小豆7号’、‘浙春2号’和‘A7601’等。从这18个基因型中选取了诱导率有差异的5个基因型,通过凯氏定氮法分别测定其丛生芽中蛋白含量,发现丛生芽诱导率、丛生芽生长情况与丛生芽中蛋白含量之间无显著相关性。以丛生芽诱导率及生长活力、重复稳定性等方面均效果较好的基因型浙春3号作为受体材料,比较了不同浓度GA3培养基中外植体丛生芽诱导率的差异。结果显示,当GA3浓度为0.5mg/L时,丛生芽诱导率最高,与其他浓度的诱导效率有显著性差异,且丛生芽生长活力也相对较高,而浓度过高或者过低时都会使丛生芽诱导率及活力下降。2、利用农杆菌介导的带一片子叶的胚尖转化法将耐低温相关转录因子基因GmWRKY21转入‘浙春5号’和‘中黄13’两个大豆品种中。转基因植株经目的基因的PCR检测和转化T-DNA区域构建特异性的PCR检测得以确认。低温耐逆实验结果表明,胁迫处理前和处理后,转基因植株相对电导率均显著低于对照植株；与相对电导率变化不同,低温胁迫后转基因株系中脯氨酸含量的变化没有统一规律;转基因植株较非转基因对照表现出明显的低温耐性：低温胁迫后进行恢复生长,转基因植株均能正常生长、开花、结荚,而非转基因对照在处理后恢复培养七到十天内枯萎死亡。实验结果初步表明GmWRKY21基因已经成功导入大豆基因组中并参与了对低温的胁迫应答,进而提高了大豆的抗低温胁迫能力。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 1 文献综述
• 1.1 常用遗传转化方法
• 1.1.1 基因枪法
• 1.1.2 花粉管通道法
• 1.1.3 电激法
• 1.1.4 农杆菌介导法
• 1.2 影响农杆菌介导大豆遗传转化的主要因素
• 1.2.1 大豆基因型
• 1.2.2 农杆菌菌株
• 1.2.3 侵染共培养条件
• 1.3 大豆遗传转化的主要障碍
• 1.3.1 遗传转化频率较低且可重复性差,稳定性不高
• 1.3.2 组织培养繁杂,植株再生困难
• 1.4 小结
• 3浓度测定'>2 大豆子叶节再生系统的基因型筛选与最适GA₃浓度测定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 转化方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 18个大豆基因型的丛生芽诱导率差异
• 2.2.2 5个大豆基因型的丛生芽蛋白含量统计
• 3）对丛生芽诱导分化的影响'>2.2.3 赤霉素（GA₃）对丛生芽诱导分化的影响
• 2.3 讨论
• 2.4 结论
• 3 转化GMWRKY21基因提高大豆耐低温性的研究
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 转化方法
• 3.1.3 转基因植株的检测及耐低温鉴定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 转基因植株的目的基因PCR检测
• 3.2.2 转基因植株的构建特异性PCR检测
• 3.2.3 低温处理对转基因植株及其对照相对电导率的影响
• 3.2.4 低温处理对转基因植株及其对照脯氨酸含量的影响
• 3.2.5 转基因植株低温耐逆性实验
• 3.3 讨论
• 3.4 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间取得的研究成果
• 致谢