胰腺星状细胞在胰腺纤维化中的作用及丹酚酸B的干预阻断研究

论文摘要

胰腺星状细胞（pancreatic stellate cells,PSCs）位于胰腺小叶间和腺泡周围区,围绕邻近腺细胞基底部,与慢性胰腺炎和胰腺癌密切相关的一类肌成纤维细胞样细胞。在未损伤的胰腺组织中,胰腺星状细胞呈静止状态,胞内富含Vit A脂滴和油脂酸视黄醇,具有摄取和酯化视黄醇的能力,结蛋白（desmin）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色阳性。当胰腺受损后,胰腺星状细胞活化,发生形态学和功能学的双重变化,表现为:细胞体积变大,增殖活跃;脂质丢失;仅α-平滑肌肌动蛋白（alpha-SMA）表达阳性;对细胞因子如血小板衍生生长因子（PDGF）、转化生长因子-β（TGF-β）反应性增加;分泌细胞外基质（ECM）,尤其是Ⅰ、Ⅲ型胶原。慢性胰腺炎（chronic pancreatitis,CP）是指由于各种不同病因引起的胰腺组织和功能的持续性损害,其特征为胰腺基本结构发生永久性改变,广泛纤维化,即使病因已去除仍常伴胰腺的功能性缺陷。临床上以反复发作的上腹部疼痛和胰腺外分泌功能不全为主要特征,可合并胰腺内分泌功能不全、胰腺实质钙化、胰管结石和胰腺假性囊肿形成。慢性胰腺炎病程迁延,临床表现多样,严重影响患者的日常生活。并且有报道认为慢性胰腺炎是胰腺癌的危险因素之一。但目前对慢性胰腺炎的病因、发病机制尚不甚清楚,慢性胰腺炎的治疗更为棘手。胰腺纤维化的形成是一个由复杂的信号网络通路所介导的、以胰腺星状细胞活化为中心、多种细胞因子与炎性介质参与的、最终以成纤维细胞增生和细胞外基质（ECM）沉积为特征的复杂的病理发展过程。胰腺星状细胞活化是胰腺纤维化发生的关键步骤,因此抑制胰腺星状细胞活化在抗胰腺纤维化过程中占有重要地位。体内外实验均证实细胞因子、乙醇及其代谢产物乙醛、氧应激等能促进胰腺星状细胞活化。活化的胰腺星状细胞分泌ECM成分,促进胰腺纤维化形成。在胰腺星状细胞活化通路中,丝裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPKs）信号传递途径是最为重要一条。ERK通路的主要功能是介导有丝分裂信号向胞核传递,调控细胞的生长。Jaster等在研究细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）通路与PSC活化的关系时,发现不同转化阶段的PSC都能持续表达磷酸化的Smads;血小板衍生生长因子（PDGF）在促进PSC增殖的同时增加ERK通路成分的表达;应用Trapidil或PD98059（MAPK激酶的抑制剂）均可以抑制PSC的增殖。这也证实ERK通路在PSC的活化中起到了重要作用。丹酚酸B（Salvianolic acid B,Sal-B）,又称丹参酚酸B或丹酚酸乙,是唇形科植物丹参Salvia Miltiorrhiza Bge.的根及根茎提取而得,为三分子丹参素与一分子咖啡酸缩合而成。丹酚酸B具有活血化瘀,通经活络之功效,是目前研究较多的丹酚酸之一,对心、脑、肝、肾等器官均具有重要药理作用。药理学研究发现丹酚酸B具有很强的抗氧化、抗纤维化、抗肿瘤作用,抑制血小板聚集和抑制血栓形成作用,并能延长缺氧条件下动物的存活时间。实验证明,丹酚酸B能抑制TGF-β的肝星状细胞胞（HSC）内信号转导及其受体蛋白的表达,拮抗TGF-β的促HSC活化,还能抑制HSC增殖和胶原合成。我们试图通过丹酚酸B灌胃治疗大鼠慢性胰腺炎模型,观察血液生化指标、胰腺病理改变、胰腺星状细胞激活状态和胶原蛋白的表达,初步阐明丹酚酸B对慢性胰腺炎的保护作用及可能机制。并且通过丹酚酸B干预大鼠胰腺星状细胞,观察胰腺星状细胞活化,胶原蛋白和细胞外信号调节激酶（ERK1/2）表达水平,进一步阐明丹酚酸B对胰腺星状细胞的保护作用及机制。方法:1)动物模型建立与胰腺星状细胞评价雄性大鼠行胆胰管注射2%TNBS乙醇磷酸盐缓冲液诱导慢性胰腺炎模型,分别于术后2周4周和8周处死大鼠行胰腺病理学检查,采用文献报道的胰腺组织学评分方法,主要评价胰腺腺泡细胞萎缩,纤维化和炎症细胞浸润;免疫组化检测胰腺星状细胞活化的情况;RT-PCR检测Ⅰ胶原蛋白mRNA表达水平。同时设立相应的对照组。2)丹酚酸B动物试验雄性大鼠行胆胰管注射2%TNBS乙醇磷酸盐缓冲液诱导慢性胰腺炎模型,分为模型对照组（组1）和丹酚酸B治疗组（组2）,组3是胆胰管注射乙醇磷酸盐缓冲液的对照组（非模型对照组）,组4是假手术组。30只大鼠胆胰管注射2%TNBS乙醇磷酸盐缓冲液诱导慢性胰腺炎模型,12只大鼠胆胰管注射乙醇磷酸盐缓冲液,12只大鼠接受假手术。每组各取10只大鼠进入正式实验,第5周开始,组2接受每天10mg/kg体重的丹酚酸B灌胃治疗,组1、组3和组4接受等体积的生理盐水灌胃,共治疗8周。治疗结束时抽取血标本,分离血清,行血清生化和纤维化指标检测;同时分离胰腺称重,并取胰腺组织中性福尔马林固定用于形态学研究;免疫组化检测胰腺星状细胞活化的情况;取部分胰腺组织抽提总RNA检测Ⅰ胶原蛋白mRNA表达水平。3)细胞增殖抑制试验采用MTT方法,取对数生长期的细胞PSC（LTC-14,德国Robert Jaster教授涝?,用0.25%胰酶消化为单个细胞,作细胞计数,以培养液稀释为终浓度为2×104/ml的单细胞悬液,每孔190ul接种于96孔培养板中,置37℃、5%CO2培养箱中过夜,待细胞贴壁后进行试验。将稀释为不同浓度的丹酚酸B 10ul分别加入各孔中（终浓度为1μmol/L,10μmol/L,100μmol/L）,每个浓度设5个复孔,并设只加细胞不加药液的对照孔和只加培养液的调零孔。继续培养48小时后,进行MTT检测。选择570nm波长,在免疫酶标仪上比色测定OD值,记录结果。4）丹酚酸B细胞试验取对数生长期LTC-14细胞,消化为单个细胞,以培养液稀释为终浓度为1×105/ml的单细胞悬液,每孔接种4×104的单细胞悬液于6孔培养板中,置37℃、5%CO2培养箱中过夜,待细胞贴壁后进行试验。将稀释为不同浓度的丹酚酸B加入各孔中（终浓度为1μmol/L,10μmol/L,100μmol/L）,以等体积的PBS作为对照。培养48小时后收集细胞抽提总RNA行RT-PCR检测alpha-平滑肌肌动蛋白和Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达水平。免疫印迹检测Ⅰ型胶原蛋白和细胞外信号调节激酶（ERK1/2）表达水平。结果:1)动物模型建立与胰腺星状细胞评价胆胰管注射TNBS成功诱导慢性胰腺炎,术后第2周胰腺组织有炎症细胞浸润,未见明显萎缩和纤维化,免疫组化提示少量alpha-平滑肌肌动蛋白阳性细胞,第4周胰腺组织表面苍白、不规则、结节状,胆胰管明显扩张,内含淡黄色液体;HE染色光镜观察胰管周围、小叶间和小叶内广泛纤维化,伴炎症细胞浸润,局灶腺体萎缩,免疫组化明显alpha-平滑肌肌动蛋白阳性细胞,第8周胰腺组织改变与第4周相似,但病理该变更严重,alpha-平滑肌肌动蛋白阳性细胞更多。术后第2周胰腺组织Ⅰ型胶原蛋白mRNA水平已经升高,第4周胰腺组织Ⅰ型胶原蛋白mRNA水平明显升高,第8周升高幅度更大。2)丹酚酸B动物试验（1）丹酚酸B改善大鼠慢性胰腺炎模型病理形态:第12周末,模型对照组大鼠胰腺腺泡萎缩、间质水肿、炎症细胞浸润和纤维化明显。丹酚酸B可以明显改善胰腺组织病理损害。与模型对照组和丹酚酸B治疗组比较,非模型对照组和假手术组大鼠胰腺无或仅有轻微病理损害。模型对照组大鼠胰腺的组织病理学评分明显高于丹酚酸B治疗组（p＜0.01）。丹酚酸B治疗组大鼠胰腺的腺泡萎缩和纤维化评分明显低于模型对照组（p＜0.05）,而炎症细胞浸润评分没有差别（p＞0.05）。（2）丹酚酸B抑制大鼠慢性胰腺炎模型的胰腺星状细胞活化:模型对照组大鼠胰腺中有明显的alpha-SMA阳性细胞。与模型对照组和丹酚酸B治疗组比较,非模型对照组和假手术组大鼠胰腺仅有少数alpha-SMA阳性细胞。丹酚酸B治疗组大鼠胰腺的alpha-SMA阳性细胞明显少于模型对照组。（3）丹酚酸B抑制慢性胰腺炎模型胰腺组织Ⅰ胶原蛋白mRNA表达:与模型对照组比较,丹酚酸B可以明显抑制胰腺组织Ⅰ胶原蛋白mRNA表达（p＜0.01）。与非模型对照组和假手术组大鼠相比,模型对照组大鼠的胰腺组织Ⅰ胶原蛋白mRNA水平明显升高（p＜0.01）,而丹酚酸B治疗组大鼠的胰腺组织Ⅰ胶原蛋白mRNA升高水平没有统计学差异（p＞0.05）。3)胰腺星状细胞增殖抑制试验根据MTT结果,丹酚酸B1μmol/L组对PSC细胞没有明显的增殖抑制作用（p＞0.05）,而丹酚酸B10μmol/L和100μmol/L组与对照组相比,丹酚酸B对PSC细胞有明显的增殖抑制作用（p＜0.01）。4)丹酚酸B细胞试验（1）丹酚酸B抑制胰腺星状细胞alpha平滑肌肌动蛋白和Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达:与对照组相比,丹酚酸B组胰腺星状细胞alpha平滑肌肌动蛋白和Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达明显下调,而且随着丹酚酸B1μmol/L,10μmol/L和100μmol/L逐步升高,胰腺星状细胞alpha平滑肌肌动蛋白和Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达逐步下调。（2）丹酚酸B抑制胰腺星状细胞Ⅰ型胶原蛋白表达:与对照组相比,丹酚酸B1μmol/L组胰腺星状细胞Ⅰ型胶原蛋白表达没有下调,但丹酚酸B10μmol/L和100μmol/L组胰腺星状细胞Ⅰ型胶原蛋白表达明显下调,且随着丹酚酸B浓度升高,胰腺星状细胞Ⅰ型胶原蛋白表达逐步下调。（3）丹酚酸B抑制胰腺星状细胞细胞外信号调节激酶（ERK1/2）表达:与对照组相比,丹酚酸B组胰腺星状细胞细胞外信号调节激酶（ERK1/2）表达明显下调,而且随着丹酚酸B1μmol/L,10μmol/L和100μmol/L逐步升高,胰腺星状细胞细胞外信号调节激酶（ERK1/2）表达逐步下调。结论:1)胆胰管注射法诱导的慢性胰腺炎模型基本符合人类慢性胰腺炎特征,胰腺星状细胞在慢性胰腺炎发生发展中起重要作用;2)丹酚酸B通过抑制胰腺星状细胞细胞外信号调节激酶活性,降低alpha平滑肌肌动蛋白mRNA表达水平和抑制胰腺星状细胞活化;3)丹酚酸B通过抑制胰腺星状细胞活化,减少Ⅰ胶原蛋白和改善慢性胰腺炎大鼠模型胰腺组织病理损害。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 英文缩略词表
• 目次
• 正文
• 第一部分 慢性胰腺炎胰腺星状细胞活化的实验研究
• 引言
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 4.小结
• 第二部分 丹酚酸B改善慢性胰腺炎病理形态和抑制胰腺星状细胞活化的实验研究
• 引言
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 4.小结
• 第三部分 丹酚酸B抑制胰腺星状细胞活化的分子机制研究
• 引言
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 4.小结
• 本研究结论
• 本研究创新点
• 展望
• 参考文献
• 综述
• 作者简历