番茄斑萎病毒的分离鉴定及表达dsRNA的转基因烟草的抗病性研究

论文摘要

番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus, TSWV）隶属于布尼亚病毒科（Bunuyaviridae）番茄斑萎病毒属（Tospovirus）, Tospovirus是Bunuyaviridae中唯一一个可以侵染植物的属。TSWV广泛分布于世界各地,可侵染100多个科1000多种植物,常造成严重的经济损失,但在我国报道很少。近年来,随着其主要传毒介体——西花蓟马（Frankliniella occidentalis）的传播和扩散,我们发现TSWV也在逐渐蔓延扩散,分布范围日益扩大,寄主种类也在不断增加,加之TSWV难以防治,对农业生产构成了越来越严重的威胁。为了探究TSWV的扩散蔓延趋势,建立有效的TSWV防治方法,从2009～2013年,作者从云南等地采集了18份样本,分离纯化了部分TSWV株系,并对其进行了进化分析；利用RNAi,成功构建了不同片段长度的反向重复dsRNA植物表达载体,转化烟草后获得了转基因植株；并对表达TSWV dsRNA的转基因烟草的抗病性进行了初步的研究与分析。本研究的主要内容和结果如下：1.番茄斑萎病毒的分离及鉴定首次从鸢尾和豇豆上分离得到TSWV。本文对采自不同地区疑似TSWV症状的样品进行了分离鉴定。从采自云南农业大学校园内的鸢尾叶片上,分离得到病原物,通过寄主症状鉴定,ELISA检测和进一步的分子生物学鉴定,确定该分离物为TSWV分离物,命名为YN-2。克隆了YN-2N基因和GN/GC基因的全长序列,经测序,YN-2N基因全长777bp （GenBank登录号：KC294570）,编码258个氨基酸,GN/GC基因全长3408bp（GenBank登录号：KC294569）,编码1135个氨基酸。经过与GenBank所登录的其他株系比对后,结果显示,YN-2与来自云南的番茄上（YN01）分离的TSWV的相似性最高：YN-2N基因和GN/GC基因与其相似性分别高达99.74%和99.53%；但在同源进化树分析中,TSWV N基因和GN/GC基因处于不同的分组中,由此我们推断编码GN/GC基因的MRNA与编码N基因的SRNA之间可能发生了基因重配。另外,还从云南不同地区采集的番茄、辣椒和豇豆上分离得到了8个TSWV分离物,并对8个分离物的N基因和GN/GC基因进行了克隆与分析。8个分离物的N基因全长均为777bp,均编码258个氨基酸；GN/GC基因全长均为3408bp,均编码1135个氨基酸。8个分离物的N基因和GN/GC基因与GenBank中登录的中国的其他株系的N基因和GN/GC基因进行相似性比对后,结果显示,8个分离物的N基因和GN/GC基因与中国的其他株系的N基因和GN/GC基因相似性分别高达99.34%和99.38%。通过同源进化树分析发现,8个分离物虽然源自不同的寄主植物,但其起源是一致的。2.转TSWV N基因dsRNA载体烟草及其抗病性研究本研究将利用RNAi成功构建的2个不同片段长度的TSWV N基因dsRNA植物表达载体（±313-1304载体和±536-1304载体,简称313载体和536载体）通过农杆菌介导法转化烟草。并获得转313载体的三生烟阳性植株60株,转356载体的三生烟阳性植株79株,对To代和T1代转基因烟草进行了攻毒试验,攻毒试验结果表明：转536载体的T0代和T1代烟草植株的抗病效果均优于转313载体的T0代和T1代烟草植株的抗病效果；两种类型的转基因阳性植株T0代的抗病效果明显优于T1代的抗病效果。3. TSWV GN/GC基因dsRNA载体构建及其在烟草中的表达利用RNAi,成功构建了4个TSWV GN/GC基因不同区域及不同片段长度的反向重复dsRNA植物表达载体。根据TSWV GN/GC全长基因序列,设计含有限制性内切酶酶切位点（SwaI,AscI,SpeI,BamHI）的引物,扩增含有酶切位点的长度分别为297bp、500bp、328bp和503bp的目的片段,用于构建反向重复dsRNA植物表达载体。以最成熟的dsRNA载体pFGC1008为构建dsRNA的中间载体,其内含子是GUS基因的一段长为335bp的序列,反向重复dsRNA的植物表达载体为pCAMBIA1304,经PCR筛选、酶切和测序等方法进行验证,均表明已经成功的构建了重组载体,并且与预期相同。将构建好的4个dsRNA植物表达载体通过农杆菌介导的方法转化烟草,目前已获得转G13-1304三生烟阳性植株20株,转G15-1304三生烟阳性植株20株,转G23-1304三生烟阳性植株15株,转G25-1304三生烟阳性植株16株。对转基因烟草的抗病性评价需要进一步的研究与分析。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 番茄斑萎病毒
• 1.1 番茄斑萎病毒分类学地位、基因组结构及其病原形态学
• 1.1.1 番茄斑萎病毒的分类学地位
• 1.1.2 番茄斑萎病毒的基因组结构
• 1.1.3 番茄斑萎病毒病的病原形态学
• 1.2 番茄斑萎病毒病的传播方式及传播介体
• 1.3 番茄斑萎病毒病的危害症状及国内外发生现状
• 1.3.1 番茄斑萎病毒病的危害症状
• 1.3.2 国内番茄斑萎病毒病的发生现状
• 1.3.3 国外番茄斑萎病毒病的发生现状
• 1.4 番茄斑萎病毒病的防治
• 2 基因沉默
• 2.1 基因沉默现象的发现
• 2.2 基因沉默的定义
• 2.3 基因沉默的分类
• 2.4 RNA沉默的途径及机制
• 2.4.1 RNA沉默的途径
• 2.4.2 RNA沉默的机制
• 2.5 RNA沉默的病毒抑制子
• 2.6 RNA沉默的应用
• 2.6.1 RNA沉默在功能基因组研究上的应用
• 2.6.2 RNA沉默在作物品种改良上的应用
• 2.6.3 RNA沉默在疾病治疗上的应用
• 2.6.4 RNA沉默在植物病毒病防治上的应用
• 3 本研究的目的和意义
• 第二章 番茄斑萎病毒的分离及鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 样品来源及采样时间
• 1.1.2 菌株及质粒
• 1.1.3 酶及化学试剂
• 1.1.4 抗体
• 1.1.5 引物
• 1.1.6 抗生素
• 1.1.7 培养基及试剂的配制
• 1.1.8 分子生物学软件
• 1.2 方法
• 1.2.1 番茄斑萎病毒的分离
• 1.2.2 常规分子操作技术
• 1.2.3 血清学检测TSWV
• 2 结果与分析
• 2.1 TSWV分离物的摩擦接种
• 2.2 TSWV分离物的血清学检测
• N/G_C基因的克隆与分析'>2.3 TSWV YN-2 N基因和G_N/G_C基因的克隆与分析
• 2.3.1 TSWV YN-2 N基因的克隆与分析
• N/G_C基因的克隆与分析'>2.3.2 TSWV YN-2 G_N/G_C基因的克隆与分析
• N/G_C基因的克隆与分析'>2.4 TSWV其他分离物N基因和G_N/G_C基因的克隆与分析
• 2.4.1 TSWV其他分离物N基因的克隆与分析
• N/G_C基因的克隆与分析'>2.4.2 TSWV其他分离物G_N/G_C基因的克隆与分析
• 3 结论与讨论
• 3.1 结论
• 3.2 讨论
• 第三章 转TSWVN基因dsRNA载体烟草及其抗病性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株与载体
• 1.1.2 植物材料
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 试剂
• 1.1.5 抗生素与生长激素
• 1.2 方法
• 1.2.1 电击转化农杆菌LBA4404感受态细胞的制备与转化
• 1.2.2 冻融法转化农杆菌LBA4404感受态细胞的制备与转化
• 1.2.3 烟草遗传转化体系的建立
• 1.2.4 转基因烟草总DNA的提取
• 1.2.5 转基因烟草的筛选
• 1.2.6 转基因烟草的扩繁
• 1.2.7 转基因烟草的攻毒试验
• 2 结果与分析
• 2.1 潮霉素临界值的筛选
• 2.2 烟草的遗传转化
• 2.3 转基因烟草总DNA的提取及PCR筛选
• 2.4 含50mg/L潮霉素的MS液体培养基筛选转基因烟草
• 0代转基因烟草的无性扩繁及鉴定'>2.5 T₀代转基因烟草的无性扩繁及鉴定
• 0代转基因烟草扩繁植株的攻毒实验和抗病性分析'>2.6 T₀代转基因烟草扩繁植株的攻毒实验和抗病性分析
• 1代攻毒实验和抗病性分析'>2.7 转基因烟草T₁代攻毒实验和抗病性分析
• 3 结论与讨论
• 3.1 结论
• 3.2 讨论
• N/G_C基因dsRNA载体构建及其在烟草中的表达'>第四章 TSWV G_N/G_C基因dsRNA载体构建及其在烟草中的表达
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株与载体
• 1.1.2 酶与试剂
• 1.1.3 引物
• 1.1.4 抗生素与生长激素
• 1.1.5 培养基及试剂的配制
• 1.1.6 分子生物学软件
• 1.2 方法
• N/G_C基因正向片段和反向片段的获得'>1.2.1 不同长度的G_N/G_C基因正向片段和反向片段的获得
• N/G_C基因片段dsRNA植物表达载体的构建'>1.2.2 不同长度的G_N/G_C基因片段dsRNA植物表达载体的构建
• N/G_C基因片段dsRNA植物表达载体转化烟草'>1.2.3 不同长度的G_N/G_C基因片段dsRNA植物表达载体转化烟草
• 1.2.4 转基因烟草DNA的提取及PCR鉴定
• 2 结果与分析
• N/G_C基因正向片段和反向片段的获得'>2.1 不同长度的G_N/G_C基因正向片段和反向片段的获得
• N/G_C基因片段dsRNA植物表达载体的构建'>2.2 不同长度的G_N/G_C基因片段dsRNA植物表达载体的构建
• N/G_C基因片段dsRNA植物表达载体转化烟草'>2.3 不同长度的G_N/G_C基因片段dsRNA植物表达载体转化烟草
• 2.4 转基因烟草总DNA的提取及PCR筛选
• 3 结论与讨论
• 3.1 结论
• 3.2 讨论
• 第五章 全文总结
• 1 全文主要结果
• 2 主要创新点
• 3 预期展望
• 参考文献
• 附录A 本文所用重要缩写词及中文对照
• 附录B 本文所用缓冲液及培养基配方
• 附录C 本文所用抗生素及其使用浓度
• 附录D 本文所用化学试剂、分子生物学试剂及仪器
• 附录E 云南样品TSWV分离物N基因序列信息
• N/G_C基因序列信息'>附录F 云南样品TSWV分离物G_N/G_C基因序列信息
• 致谢
• 作者简介