首页> 正文

易错PCR介导扩展青霉脂肪酶定向进化

2020-12-14阅读(646)

易错PCR介导扩展青霉脂肪酶定向进化

论文摘要

本研究利用易错PCR技术对扩展青霉脂肪酶PEL进行定向进化。以扩展青酶脂肪酶基因为模板,通过易错PCR和转化毕赤酵母建立了约含13000个突变株的突变体库；通过酶活性的平板透明圈高通量的筛选获得了约50株的有活性的转化子；通过酶学特性分析和基因克隆测序,筛选出如下热稳定性和酶活有所改变的突变体。（1）突变体GS-pPIC3.5K-lip07-ER04,其最适作用温度比野生型提高10℃,在最适作用温度下的酶活提高了约22%,Tm值比野生型提高了3.28℃。（2）突变体GS-pPIC3.5K-lip07-ER10最适作用温度比野生型提高了5℃,在最适作用温度下的酶活为950U/mL, Tm值比野生型提高了2.15℃。（3）突变体GS-pPIC3.5K-lip07-ER15的最适作用温度没有发生变化,在最适作用温度下的酶活为935U/mL, Tm值比野生型提高了2.28℃。（4）突变体GS-pPIC3.5K-lip07-ER17最适作用温度比野生型提高了5℃,在最适作用温度下的酶活为1005U/mL, Tm值比野生型提高了1.8℃。（5）突变体GS-pPIC3.5K-lip07-ER31最适作用温度比野生型提高了5℃,在最适作用温度下的酶活为917U/mL, Tm值比野生型提高了2.25℃。（6）突变体GS-pPIC3.5K-lip07-ER38的最适作用温度没有发生变化,在最适作用温度下的酶活为1105U/mL, Tm值比野生型提高了2.81℃。（7）突变体GS-pPIC3.5K-lip07-ER45的最适作用温度未发生变化,在最适作用温度下的酶活为1060U/mL, Tm值比野生型提高了2.26℃。（8）突变体GS-pPIC3.5K-lip07-ER50的最适作用温度未发生变化,在最适作用温度下的酶活为425U/mL,降低了约42%,Tm值40.4℃。（9）突变体HR1、HR2、HR5的最适温度最适作用温度未发生变化,在最适作用温度下的酶活分别为720U/mL、612U/mL、762U/mL,变化并不明显。本研究共筛选出十一个突变体,其中七个热稳定性和酶活得以提高的正向突变体,结果说明易错PCR介导的定向突变是种很好的酶分子改造的手段,这些突变体的获得为进一步的脂肪酶定向进化打下了基础。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 中文文摘
  • 目录
  • 第1章 绪论
  • 1.1 课题背景
  • 1.2 蛋白质定向进化研究概况
  • 1.3 蛋白质定向进化的研究技术
  • 1.4 酯酶和脂肪酶的高通量筛选方法
  • 1.5 蛋白质定向进化的应用
  • 第2章 材料与方法
  • 2.1 材料
  • 2.1.1 菌种和载体
  • 2.1.2 易错PCR突变引物
  • 2.1.3 工具酶
  • 2.1.4 其它试剂
  • 2.1.5 常用培养基和缓冲液
  • 2.1.6 常用仪器
  • 2.2 方法
  • 2.2.1 易错PCR制备突变体
  • 2.2.2 突变基因的表达、筛选
  • 2.2.3 表达产物酶学性质的研究
  • 2.2.4 突变基因序列的鉴定
  • 第3章 结果与分析
  • 3.1 突变基因库的获得
  • 3.2 重组质粒库PPIC3.5K-LIP07-MUTANT X的构建
  • 3.3 突变体的筛选
  • 3.4 突变体的鉴定和特性分析
  • 3.4.1 突变体GS-pPIC3.5K-lip07-ER04
  • 3.4.2 突变体GS-pPIC3.5K-lip07-ER10
  • 3.4.3 突变体GS-pPIC3.5K-lip07-ER15
  • 3.4.4 突变体GS-pPIC3.5K-lip07-ER17
  • 3.4.5 突变体GS-pPIC3.5K-lip07-ER31
  • 3.4.6 突变体GS-pPIC3.5K-lip07-ER38
  • 3.4.7 突变体GS-pPIC3.5K-lip07-ER45
  • 3.4.8 突变体GS-pPIC3.5K-lip07-ER50
  • 3.4.9 突变体HR1、HR2、HR5
  • 第4章 讨论
  • 参考文献
  • 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
  • 致谢
  • 个人简历

    • 相关论文文献

    • [1].细菌性阴道炎检验中采取PCR检验法和细菌培养法的临床应用意义[J]. 当代医学 2019(35)
    • [2].牧草盲蝽实时定量PCR内参基因的筛选[J]. 昆虫学报 2019(12)
    • [3].呼吸道病毒多重PCR检测专利分析[J]. 科学技术创新 2019(36)
    • [4].鸡传染性贫血病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 中国家禽 2019(23)
    • [5].多重荧光定量PCR测定登革热Ⅰ～Ⅳ型方法的建立与初步评价[J]. 中国现代医生 2019(34)
    • [6].肠道轮状病毒巢式PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 临床输血与检验 2019(06)
    • [7].通过微视频让“PCR”走入高中生物学课堂[J]. 生物学教学 2020(01)
    • [8].PCR技术在植物生物学中的应用研究[J]. 生物化工 2020(01)
    • [9].双重数字PCR在转基因大豆检测中的应用[J]. 生物技术进展 2020(01)
    • [10].微滴式数字PCR检测冷冻草莓中GⅠ、GⅡ型诺如病毒[J]. 食品工业科技 2020(02)
    • [11].基层兽医实验室开展PCR检测的假阳性防范策略[J]. 中国动物保健 2020(02)
    • [12].鸡传染性喉气管炎病毒实时荧光PCR检测方法的建立与应用[J]. 中国动物检疫 2020(03)
    • [13].多花兰实时荧光定量PCR内参基因的筛选[J]. 分子植物育种 2019(24)
    • [14].提高基层非洲猪瘟荧光PCR检测准确性的措施[J]. 福建畜牧兽医 2020(01)
    • [15].PCR仪与测序仪应用于丙型肝炎病毒基因型检测的临床效果观察[J]. 中国医疗器械信息 2020(01)
    • [16].苯酚胁迫下多刺裸腹溞实时定量PCR内参基因的筛选[J]. 水生生物学报 2020(01)
    • [17].餐饮食品中蜡样芽孢杆菌的实时荧光PCR检测方法研究[J]. 福建轻纺 2020(04)
    • [18].鱼源藤黄微球菌三重PCR检测法的建立及耐药性分析[J]. 食品工业科技 2020(05)
    • [19].3种血清型沙门氏菌多重PCR检测方法的建立[J]. 食品安全质量检测学报 2020(03)
    • [20].蓝氏贾第鞭毛虫和微小隐孢子虫双重荧光定量PCR两步法检测技术的建立[J]. 中国人兽共患病学报 2020(01)
    • [21].皮内注射用卡介苗特异性鉴别试验多重PCR检测方法的建立及验证[J]. 中国生物制品学杂志 2020(02)
    • [22].蜱传脑炎病毒(TBEV)SYBR Green Ⅱ荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 中国兽医学报 2020(03)
    • [23].利用PCR法检测熟牛肉的肉源性[J]. 食品安全导刊 2020(13)
    • [24].PCR技术在食品微生物检测中的应用[J]. 食品安全导刊 2020(09)
    • [25].沙氏鹿茸草实时荧光定量PCR内参基因筛选[J]. 中国中药杂志 2020(08)
    • [26].数字PCR技术的发展与展望[J]. 猪业科学 2020(03)
    • [27].梅州地区柑橘黄龙病的常规PCR与实时荧光定量PCR检测技术研究与应用[J]. 现代农业科技 2020(08)
    • [28].快速检测洋葱伯克霍尔德菌巢式荧光定量PCR法建立[J]. 分子诊断与治疗杂志 2020(04)
    • [29].PCR技术在乙型肝炎检验中的应用效果[J]. 心理月刊 2020(07)
    • [30].PCR检测技术在真菌性角膜炎快速诊断中的应用[J]. 检验医学与临床 2020(09)

    标签：;  ;  ;  ;  ;  

    易错PCR介导扩展青霉脂肪酶定向进化
    下载Doc文档

    猜你喜欢

    © 2024 毕速过 版权所有 鄂ICP备12018319号-5