论文摘要
动物转基因技术是21世纪发展最为迅速的生物高新技术之一,是建立在细胞遗传学、分子遗传学、胚胎发育学和DNA重组技术基础之上的生物工程技术。自1997年克隆羊“多莉”的诞生以来,体细胞克隆技术成为了动物转基因技术研究的热点,并在家畜的转基因生产研究中被广泛的应用。本研究采用了体细胞核移植的转基因方法,即以毛囊特异表达的启动子pKAP6-1引导胸腺素β4（thymosin beta 4,Tβ4）基因,以新霉素抗性基因和红色荧光蛋白基因作为双选择标记,构建毛囊细胞中特异性表达Tβ4的表达载体；利用体外转染技术将表达载体导入绒山羊胎儿成纤维细胞,通过G418筛选出稳定表达红色荧光蛋白的克隆细胞；以体细胞核移植技术制备绒山羊转基因克隆胚胎；并通过胚胎移植,生产转基因绒山羊。本研究为转基因绒山羊的培育,以及探讨Tβ4在绒山羊毛囊发育和生长周期中的调控作用提供了研究基础。1.毛囊细胞特异性表达载体的构建通过PCR和RT-PCR方法分别从绵羊总DNA和绒山羊总RNA中扩增出角蛋白关联蛋白6-1基因（KAP6-1）启动子区序列和绒山羊胸腺素p4（Tβ4）编码区cDNA序列,以pMD19T为克隆骨架构建成中间克隆载体p19TKT。将CMV启动子序列连接在pDsRed2-1表达框架的红色荧光蛋白报告基因（Red2）上游KpnⅠ+SmaⅠ位点构成pCDsRed2；pCDsRed2经SacⅠ+HindⅢ酶切,与p19TKT的KT片段连接构成毛囊细胞特异表达载体pCDsR-KT。2.绒山羊胎儿成纤维细胞的体外培养及基因转染通过组织块贴附方法成功分离出绒山羊胎儿成纤维细胞,利用脂质体Lip2000TM将构建好的毛囊特异表达载体pCDsR-KT转入绒山羊胎儿成纤维细胞基因组中。再利用G418药物和红色荧光蛋白的表达双重筛选获得阳性细胞克隆,并通过PCR的方法鉴定阳性转基因细胞克隆来源细胞的胎儿性别和外源基因在细胞基因组中的整合情况。通过对转基因/非转基因细胞系生长曲线的绘制与染色体数目的分析,评估转基因细胞活性。成纤维细胞经脂质体转染后筛选,获得了同时具有G418抗性与表达红色荧光蛋白的细胞克隆,外源目的基因已经稳定整合到细胞基因组中,转基因细胞系与非转基因细胞系细胞生长曲线的各个时期特征基本保持一致,两种细胞系的染色体数目正常（2n=60）比率分别为76.7%（23/30）和83.3%（25/30）,两种细胞的染色体数目正常率相近。上述分析表明获得的转基因细胞完全可用于下一步体细胞核移植。3.利用体细胞核移植技术制备转基因绒山羊胚胎以屠宰场绒山羊卵巢为材料,采用切割法收集卵母细胞,并进行体外成熟,成熟的卵母细胞通过显微操作的方法去除核物质并注入转基因体细胞,随后利用电击的方法将二者进行融合形成重构胚胎,重构胚胎经体外激活后体外发育到4-8细胞阶段进行胚胎移植。绒山羊卵母细胞体外成熟率为77.5%,去核存活率为93.6%,重构胚胎的融合率为82.4%,体外发育卵裂率为93.5%,8-细胞率为24.5%,囊胚率为14.3%。PCR鉴定结果表明,外源基因稳定整合于转基因胚胎基因组,荧光显微镜观察红色荧光蛋白在转基因胚胎中稳定表达。为探究绒山羊的体细胞核移植过程中高效的体外激活方法,利用IA23187+6-DMAP, Ionomycin+6-DMAP,7%乙醇+6-DMAP, IA23187+CHX, Ionomycin+CHX,7%乙醇+CHX处理体外成熟卵母细胞进行体外激活研究。研究结果发现,IA23187+6-DMAP和Ⅰonomycin+6-DMAP处理卵母细胞可获得较高的囊胚率,两种方法均为激活绒山羊卵母细胞最适方法。4.转基因绒山羊的生产与PCR鉴定利用转基因体细胞核移植技术生产的转基因胚胎,进行受体山羊的胚胎移植,经过情期观察确定妊娠母羊数量并进行母羊的孕期饲养管理,最终获得19只转基因绒山羊。转基因绒山羊经过血样的提取及PCR鉴定,证明19只羔羊均为转pCDsR-KT基因绒山羊,其中从15只羔羊的基因组中检测到了胸腺素β4基因；而其他4只羔羊的基因组中整合有pCDsR-KT载体的部分序列,3只羔羊的基因组中整合有新霉素抗性基因,全部4只羔羊的基因组中都整合有CMV启动子序列。