论文摘要
核糖体合成是细胞生长和增殖的关键,核糖体RNA基因(rDNA)转录是核糖体合成的第一步也是其限速步骤。在哺乳细胞中,大约有400拷贝的rDNA,只有大约50%的基因处于转录激活状态,处于不同转录状态的rDNA有着不同的表观遗传修饰,包括组蛋白和DNA甲基化水平的不同,还有一个重要的区别就是核小体位置的不同。在细胞代谢、营养应激等条件下rDNA的转录需要受到迅速而精确的调控。rDNA转录沉默和转录活跃之间状态的变化,就涉及到核小体位置的变化,而核小体位置的滑动也需要染色质重塑复合物的参与。NoRC是ISWI类的染色质重塑复合物,以ATP和组蛋白H4尾依赖的方式诱导核小体的滑动。NoRC由两个亚基组成,ATP酶亚基SNF2h和大业基TIP5。NoRC抑制rDNA的转录通过诱导DNA甲基化和组蛋白去乙酰化。NoRC可以作为骨架,募集其它复合物修饰组蛋白,甲基化DNA,形成抑制的异染色质状态。然而,当细胞从静止或低能供应下恢复或者增加rDNA转录时,需要对抗上述抑制过程,并可能有染色质重塑复合物的参与,但激活rDNA转录的染色质重塑以及如何使激活复合物与组蛋白结合以对抗NoRC的机制仍不明确。我们以SWI/SNF染色质重塑复合物的核心亚基hSNF5为钓饵,从人胎脑的cDNA文库筛选出与其相互作用的核仁蛋白PIH1,并确定PIH1激活rDNA的转录。机制为PIH1通过与组蛋白H4的结合,竞争性抑制转录抑制复合物NoRC的结合,同时募集SWI/SNF染色质重塑复合物到rRNA基因启动子区,从而引起染色质活化和组蛋白修饰变化,进而引起rRNA基因转录激活。并以RNA聚合酶Ⅰ基因转录调控为模型,探讨染色质重塑复合物与组蛋白修饰以PIH I为枢纽协同调控基因转录的分子过程,为在染色质水平上为理解细胞如何应对能量、营养等环境变化提供新的信息。本研究以高糖刺激细胞为模型,通过RNA、nuclear runon、免疫荧光、染色质免疫共沉淀、体外结合实验,点突变等技术,研究rDNA转录激活的机制。结论:1、PIH1可以激活rRNA基因转录。2、PIH1的54位苯内氨酸和组蛋白H4N端16位赖氨酸结合。3、PIH1通过识别乙酰化的H4K16,从而与NoRC竞争性结合,募集SWI/SNF复合物到rRNA启动子区,引起染色质活化。本论文阐述了P1H1这种新蛋白的部分功能,首次报道SWI/SNF染色质重塑复合物可以促进RNA聚合酶Ⅰ基因转录的表观遗传调控机制。第二部分染色质体外组装和转录平台的建立真核细胞基因组DNA存在于染色质中。染色质结构是真核基因表达调控的关键。在染色质结构水平研究DNA参与的各种过程是必要的,为研究染色质结构在细胞核生命活动中的功能,必须应用体外体系将DNA模板组装成适当的染色质结构。本文通过表达纯化组蛋白特异伴侣NAP-1 (Nuclear AssemblyProtein-1)及SWI(Switching defective)/SNF (Sucrose nonfermenting)样染色质调整因子ACF(ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor),提取原核表达组蛋白八聚体和提取真核细胞组蛋白八聚体,建立了由质粒DNA、纯化的天然或重组组蛋白、重组NAP-1、重组ACF及ATP为核心成分的体外染色质组装的无细胞系统。同时利用真核细胞的核抽提物和纯化的质粒DNA进行了体外转录实验。初步建立了染色质体外组装的无细胞系统和体外无细胞转录系统。
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