PIH1调控核糖体RNA基因转录机制的研究

PIH1调控核糖体RNA基因转录机制的研究

论文摘要

核糖体合成是细胞生长和增殖的关键,核糖体RNA基因(rDNA)转录是核糖体合成的第一步也是其限速步骤。在哺乳细胞中,大约有400拷贝的rDNA,只有大约50%的基因处于转录激活状态,处于不同转录状态的rDNA有着不同的表观遗传修饰,包括组蛋白和DNA甲基化水平的不同,还有一个重要的区别就是核小体位置的不同。在细胞代谢、营养应激等条件下rDNA的转录需要受到迅速而精确的调控。rDNA转录沉默和转录活跃之间状态的变化,就涉及到核小体位置的变化,而核小体位置的滑动也需要染色质重塑复合物的参与。NoRC是ISWI类的染色质重塑复合物,以ATP和组蛋白H4尾依赖的方式诱导核小体的滑动。NoRC由两个亚基组成,ATP酶亚基SNF2h和大业基TIP5。NoRC抑制rDNA的转录通过诱导DNA甲基化和组蛋白去乙酰化。NoRC可以作为骨架,募集其它复合物修饰组蛋白,甲基化DNA,形成抑制的异染色质状态。然而,当细胞从静止或低能供应下恢复或者增加rDNA转录时,需要对抗上述抑制过程,并可能有染色质重塑复合物的参与,但激活rDNA转录的染色质重塑以及如何使激活复合物与组蛋白结合以对抗NoRC的机制仍不明确。我们以SWI/SNF染色质重塑复合物的核心亚基hSNF5为钓饵,从人胎脑的cDNA文库筛选出与其相互作用的核仁蛋白PIH1,并确定PIH1激活rDNA的转录。机制为PIH1通过与组蛋白H4的结合,竞争性抑制转录抑制复合物NoRC的结合,同时募集SWI/SNF染色质重塑复合物到rRNA基因启动子区,从而引起染色质活化和组蛋白修饰变化,进而引起rRNA基因转录激活。并以RNA聚合酶Ⅰ基因转录调控为模型,探讨染色质重塑复合物与组蛋白修饰以PIH I为枢纽协同调控基因转录的分子过程,为在染色质水平上为理解细胞如何应对能量、营养等环境变化提供新的信息。本研究以高糖刺激细胞为模型,通过RNA、nuclear runon、免疫荧光、染色质免疫共沉淀、体外结合实验,点突变等技术,研究rDNA转录激活的机制。结论:1、PIH1可以激活rRNA基因转录。2、PIH1的54位苯内氨酸和组蛋白H4N端16位赖氨酸结合。3、PIH1通过识别乙酰化的H4K16,从而与NoRC竞争性结合,募集SWI/SNF复合物到rRNA启动子区,引起染色质活化。本论文阐述了P1H1这种新蛋白的部分功能,首次报道SWI/SNF染色质重塑复合物可以促进RNA聚合酶Ⅰ基因转录的表观遗传调控机制。第二部分染色质体外组装和转录平台的建立真核细胞基因组DNA存在于染色质中。染色质结构是真核基因表达调控的关键。在染色质结构水平研究DNA参与的各种过程是必要的,为研究染色质结构在细胞核生命活动中的功能,必须应用体外体系将DNA模板组装成适当的染色质结构。本文通过表达纯化组蛋白特异伴侣NAP-1 (Nuclear AssemblyProtein-1)及SWI(Switching defective)/SNF (Sucrose nonfermenting)样染色质调整因子ACF(ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor),提取原核表达组蛋白八聚体和提取真核细胞组蛋白八聚体,建立了由质粒DNA、纯化的天然或重组组蛋白、重组NAP-1、重组ACF及ATP为核心成分的体外染色质组装的无细胞系统。同时利用真核细胞的核抽提物和纯化的质粒DNA进行了体外转录实验。初步建立了染色质体外组装的无细胞系统和体外无细胞转录系统。

论文目录

  • 目录
  • 第一部分 PIH1激活rRNA转录机制的研究
  • 缩写词表
  • 中文摘要
  • Abstract
  • 前言
  • 材料方法
  • 一、试剂与材料
  • 二、菌株、细胞株和质粒
  • 三、主要实验方法
  • (一) 感受态大肠杆菌的制备
  • (二) 质粒DNA的转化
  • (三) 质粒DNA的碱法小量制备
  • (四) 质粒DNA的大量制备
  • (五)琼脂糖凝胶制备及电泳
  • (六) 限制性内切酶的酶切反应
  • (七) 从琼脂糖凝胶中同收DNA片段
  • (八) DNA片段的连接
  • (九) 质粒定点突变
  • (十)细胞培养
  • (十一) 细胞处理
  • (十二) 细胞冻存和复苏
  • (十三) 质粒转染细胞
  • (十四) 细胞总RNA的制备
  • (十五) RT-PCR以及PCR扩增
  • (十六) 双报告基因检测人rDNA基因启动子(pHrD-IRES-luc)的活性
  • (十七) Real-time RT-PCR
  • (十八) 染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)
  • (十九) 基因组DNA的提取
  • (二十) 免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation)
  • (二十一) GST-PULL DOWN
  • (二十二) 体外结合实验
  • (二十三) Tandem Affinity Purificaion(TAP)
  • (二十四) 免疫荧光分析
  • (二十五) 多组织Northern膜杂交
  • (二十六) Western印迹分析
  • (二十七) 原核表达纯化组蛋白
  • (二十八) 核仁提取
  • (二十九) Peptide pulldown
  • (三十) Nuclear runon
  • 结果
  • 一、PIH1—SNF5结合蛋白
  • 1、体内体外验证PIH1和SNF5结合
  • 2、PIH1和SNF5共定位于细胞核内
  • 3、PIH1的组织分布
  • 4、PIH1通过SNF5和SWI/SNF染色质重塑复合物ATP酶亚基Brg1相互作用
  • 二、PIH1激活rRNA基因转录
  • 1、PIH1,SNF5以及Brg促进核糖体RNA基因表达升高
  • 2、PIH1促进rRNA基因转录
  • 3、检测核仁中PIH1及SWI/SNF核心组分SNF5,Brg1的分布
  • 三、PIH1通过SNF5和Brg1活化rDNA启动子区的染色质状态
  • 四、PIH1与组蛋白H4结合
  • 1、PIH1与组蛋白H4结合
  • 2、组蛋白H4 16位赖氨酸对结合PIH1起关键作用
  • 3、PIH1与TIP5竞争性结合于H4K16位点
  • 五、PIH1 N端54位苯丙氨酸(F54)为激活rDNA转录所必需
  • 1、PIH1的N端61个氨基酸是其激活rDNA转录的关键部分
  • 2、P1H1 F54位点突变降低与H4结合能力
  • 3、PIH1点突变不影响与SNF5的结合
  • 4、PIH1 54位苯丙氨酸是其发挥功能所必需
  • 六、PIH1在高糖诱导rRNA基因转录中的功能
  • 1、高糖诱导pre-rRNA表达显著增加
  • 2、葡萄糖诱导rRNA基因启动子区染色质修饰变化
  • 3、葡萄糖通过PIH1促使rDNA启动子区染色质修饰改变
  • 讨论
  • 小结
  • 第二部分 染色质体外组装和转录平台的建立
  • 中文摘要
  • Abstract
  • 前言
  • 材料方法
  • 一、试剂与材料
  • 二、菌株、细胞株和质粒
  • 三、主要实验方法
  • (一) 提取核抽提物
  • (二)原核表达纯化组蛋白八聚体
  • (三) 提取HeLa细胞组蛋白八聚体
  • (四) Sf9细胞的培养和保存
  • (五) 昆虫表达纯化NAP-1
  • (六) 昆虫表达纯化ACF
  • (七) 染色质体外组装及转录
  • 实验结果
  • 1、提取HeLa细胞核心组蛋白八聚体
  • 2、NAP-1蛋白表达纯化
  • 3、ACF的表达纯化
  • 4、原核表达纯化GAL4-VP16融合蛋白
  • 5、原核表达纯化组蛋白
  • 6、利用纯化的蛋白进行染色质体外组装
  • 7、利用细胞核抽提物进行质粒模板体外转录
  • 小结
  • 文献综述
  • 参考文献
  • 致谢
  • 个人简历
  • 相关论文文献

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