抗人CD80单链抗体（ScFv）及双价抗体（diabody）的研制及生物学功能初步研究

论文摘要

CD80（也称B7-1）是B7家族重要的共刺激分子。人CD80分子编码基因定位于人类染色体3q13.3-q21区内,含有1491bp。CD80是分子量约为44-54kD的Ⅰ型跨膜糖蛋白,主要表达在专职性抗原提呈细胞（antigen-presenting cell,APC）树突状细胞、单核-巨噬细胞及B淋巴细胞。CD80分子的配体为表达在T淋巴细胞表面的CD28和CTLA-4。CD80与CD28结合为T细胞的活化提供第二信号,促进T细胞的增殖与分化;而与CTLA-4结合介导抑制信号,从而下调或终止T细胞效应。若缺乏此共刺激信号,抗原特异性的第一信号非但不能有效激活特异性T细胞,反而导致T细胞无能,或者耐受。研究表明,CD80介导的信号通路不仅能调节T细胞活化过程,而且还参与许多疾病的发生发展及预后状况。单链抗体（single-chain variable fragment,ScFv）是一种小分子的抗体,含有完整的抗原结合位点,由重链可变区（the variable heavy chain,VH）和轻链可变区（the variable light chain,VL）通过一段连接肽连接而成,大小为26-28kDa。VH和VL之间的连接肽长度为10-25个氨基酸,最为普遍的为（Gly4Ser）3十五肽。Diabody是单链抗体的二聚体形式,是通过将单链抗体VH和VL之间的连接肽缩短至3-10个氨基酸时,可促进分子间VH和VL的配对而形成。第一部分抗人CD80单链抗体（ScFv）的研制及生物学功能初步研究1.目的:构建及表达抗人CD80单链抗体（ScFv）,鉴定其抗原抗体结合活性,并初步研究其生物学功能。2.方法:采用RT-PCR法从分泌鼠抗人CD80 McAb的杂交瘤细胞株（4E5）中克隆VH和VL基因。用重叠延伸拼接PCR方法构建具有前导肽的L-VH-Linker-VL单链抗体基因,并克隆至pIRES2-EGFP表达载体,脂质体法转染中华仓鼠卵巢细胞（CHO）,G418加压筛选。纯化抗人CD80-ScFv,分析其效价,并鉴定其对膜型CD80的识别。竞争抑制实验分析抗人CD80-ScFv与相应抗原的结合能力。MTT法体外分析抗人CD80-ScFv对Raji细胞体外增殖的抑制作用和对CD80介导的共刺激信号的阻断作用。3.结果:构建的抗人CD80-ScFv基因全长为828bp,经测序含有信号肽和连接肽编码基因。实验获得稳定分泌细胞株（命名为SA-Ⅱ）。上清中抗体得率为15.12mg/L,相对效价为2.0μg/5×105个细胞。该抗体与天然表达CD80分子的Raji和Daudi细胞阳性结合率分别为96.6%和95.0%。抗人CD80-ScFv对鼠源亲本抗体4E5与抗原结合的竞争抑制率达98.67%,并能抑制Raji细胞的体外增殖,而且能阻断CD80介导的共刺激信号转导,抑制PBMC的增殖,增殖率下降43.48%。4.结论:成功构建的表达抗人CD80-ScFv的细胞株,其分泌的抗体具有良好的生物学活性。该抗体的研制在CD80及相关分子的基础或/及临床研究中具有重要的应用价值。第二部分抗人CD80双价抗体（diabody）的研制及生物学功能初步研究1.目的:构建及表达抗人CD80双价抗体（diabody）,并初步研究其生物学功能。2.方法:PCR法获得轻重链可变区基因,构建表达载体pIRES2- EGFP/diabody。将pIRES2-EGFP/diabody转染中华仓鼠卵巢细胞（CHO）,G418加压,筛选稳定高表达细胞株,扩大培养并收集上清,经镍柱纯化,并经变性及非变性SDS-PAGE电泳对抗体分子的双体性进行鉴定。以鼠源性亲本抗体4E5为对照,测定抗人CD80-diabody的效价。采用免疫荧光及流式细胞术（FCM）分析抗体与细胞膜型CD80分子的结合活性及与鼠源性亲本抗体4E5的竞争抑制效应;MTT法分析该抗体对天然高表达CD80的Raji细胞体外增殖的影响,同时分析其对CD80介导的共刺激信号阻断作用的影响。3.结果:成功构建抗人CD80-diabody表达载体,基因全长为798bp,含有信号肽和Gly4Ser连接肽编码基因。获得了稳定分泌双价抗体的细胞株（命名为SA-Ⅲ）,培养上清中纯化抗体的得率为15mg/L,PAGE结果显示其为一个二聚体,Mr约为53kD（a抗人CD80-ScFv Mr约为27kDa）。抗人CD80-diabody的效价为1.5μg/5×105个细胞,与L929-CD80、Raji及Daudi的阳性结合率分别为96.5%、98.1%及93.0%;该抗体对鼠源亲本抗体4E5与抗原结合的抑制率为97.11%,对Raji细胞体外增殖的抑制率达31.27%。同时也能阻断CD80介导的共刺激信号。与单链抗体相比,亲和活性明显提高。4.结论:成功获得了分泌抗人CD80-diabody的CHO细胞株,该抗体具有良好的生物学活性,亲和活性较单链抗体也明显提高,为进一步对CD80分子的研究奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 研究背景
• 参考文献
• 第一部分 抗人CD80 单链抗体（ScFv）的研制及生物学功能初步研究
• 1 材料和试剂
• 2 方法
• 3 结果
• 讨论
• 参考文献
• 附录
• 第二部分 抗人CD80 双价抗体（diabody）的研制及生物学功能初步研究
• 1 材料和试剂
• 2 方法
• 3 结果
• 讨论
• 参考文献
• 附录
• 全文总结与展望
• 本研究所获得的基金资助
• 硕士研究生期间发表的论文
• 基因工程小片段抗体及其应用
• 参考文献
• 缩写词表
• 致谢