抗人肝纤维化噬菌体单链抗体初级库的构建

论文摘要

目的构建库容量大、特异性强的抗人肝纤维化噬菌体单链抗体初级库,为抗体库的进一步筛淘打下基础,为肝纤维化的早期诊断与治疗提供新思路、新方法。方法采用人肝星状细胞株LX-2腹腔注射免疫Balb/c小鼠,用ELISA方法检测小鼠血清抗体效价。无菌条件下取出脾脏并研磨成组织匀浆,应用Trizol试剂提取总RNA,电泳及吸光度（OD260/OD280）检测RNA有无降解及其纯度。Poly AT tract’mRNA纯化系统纯化mRNA。测定mRNA含量及OD260/OD280值。以随机六聚体为引物,mRNA为模板,加入逆转录酶,合成单链cDNA片段第一链。以cDNA第一链为模板,PCR扩增抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）。将等量重、轻链扩增产物与linker引物混合,合成VH—linker—VL,加入引物,在其5’端和3’端分别设计带有内切酶Sfi I和Not I的酶切位点,PCR扩增,装配成ScFv基因。将ScFv基因分别经限制性内切酶Sfi I和Not I消化,纯化并定量消化后产物。以T4 DNA连接酶将ScFv基因与同样经Sfi I和Not I消化过的噬菌体载体pCANTAB 5E连接形成ScFv/pCANTAB 5E基因片段。采用电穿孔方法将ScFv/pCANTAB 5E转化入E.coliTG1感受态细胞内,涂SOBAG平板,加入辅助噬菌体M13K07进行挽救,构建噬菌体抗体初级库。通过以下步骤鉴定抗人肝纤维化噬菌体单链抗体初级库:①由SOBAG平板随机挑取3个菌落,扩增后提取噬菌体,琼脂糖凝胶电泳观察提取物;②以提取的噬菌体为模板,用RS引物进行PCR扩增,电泳观察扩增产物;③将提取的噬菌体用限制性内切酶Sfi I和Not I消化,电泳观察消化后产物。结果小鼠抗人肝纤维化抗体效价为1:512。提取的总RNA电泳后有三条带,提示无降解,且OD260/OD280值为1.95,纯化mRNA后测得其浓度为253ug/mL,OD260/OD280值为2.03。通过RT-PCR成功地扩增出重链（VH）和轻链（VL）,基因片段大小位于250bp和500bp之间。采用重叠延伸PCR将轻重链基因串联,获得的单链抗体基因大小约750bp。将ScFv基因与噬菌体载体pCANTAB 5E连接形成的ScFv/pCANTAB 5E基因片段通过电穿孔法转化入E.coli TG1感受态细胞内,成功构建了抗人肝纤维化噬菌体单链抗体初级库,抗体库容量为6.5×106。菌落扩增后抽提出与自联噬菌体大小相仿的噬菌体。PER扩增和内切酶消化后产物琼脂糖凝胶电泳均可见约750bp的ScFv片段。结论成功构建了库容量大的抗人肝纤维化噬菌体单链抗体初级库。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 实验材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附表与插图
• 缩略词表
• 论文及参与课题
• 致谢