论文摘要
异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT）是目前治疗良、恶性血液病、重症联合免疫缺陷、某些自身免疫性疾病及一些实体肿瘤等疾病的重要手段。但是国内独生子女在新一代中,亲缘供者不足10%,而非亲缘供者HLA全相合的几率则更小,因此如果进行半相合移植,则是解决供者来源的重要手段。但是半相合移植由于组织相容性差,重度移植物抗宿主病（graft-versus-host disease,GVHD）的发生率高,已知GVHD的发生主要同移植物中供者T细胞的活化相关,而T细胞的活化需要由共刺激分子参与的第二信号与抗原信号（抗原肽-TCR-MHC构成的第一信号）共同存在,前期的研究已发现通过阻断一些共刺激分子通路可以降低GVHD的发生。LIGHT、HVEM是近年来发现的一对新的共刺激分子,该通路对T细胞的活化起正性刺激作用,但是对于该通路是否参与GVHD发病中供者T细胞活化这一重要环节,是否能够通过干预这一共刺激通路来预防和治疗GVHD,尚未可知。针对以上现状,本课题拟解决以下几个主要问题:1、动态监测临床allo-HSCT患者外周血T细胞LIGHT、HVEM的表达情况以及细胞因子的分泌情况,探讨LIGHT-HVEM通路和细胞因子与GVHD发生、发展间的关系;2、体外通过单向混合淋巴细胞培养证实应用LIGHT单抗阻断LIGHT-HVEM通路可诱导供鼠T淋巴细胞产生对已接触过的受鼠正常组织抗原的特异性的免疫耐受;3、建立MHC半相合小鼠骨髓移植急性GVHD模型,即C57BL/6小鼠（H-2b）→CB6F1小鼠（BALB/c×C57BL/6）(F1,H-2b/d),并以通过体外阻断LIGHT-HVEM通路诱导对受者抗原特异性的免疫耐受的供鼠T淋巴细胞输注给半相合骨髓移植模型的受鼠,观察对半相合小鼠骨髓移植后急性GVHD发生的影响。第一部分Allo-HSCT患者T细胞LIGHT、HVEM表达及细胞因子分泌变化与GVHD发生、发展间关系的研究方法1、病例资料:为我科及上海市第一人民医院2007年4月～2008年2月间进行异基因造血干细胞移植的患者,共26例,女性9例,男性17例,中位年龄28岁（10～51岁）。其中急性白血病15例（急性髓细胞白血病5例,急性淋巴细胞白血病10例）,慢性白血病7例,恶性淋巴瘤1例,再生障碍性贫血3例,随访时间3个月以上。14例为同胞供者,4例为HLA半相合供者（母亲供者3例,父亲供者1例）,无关供者8例。同时以第二军医大学血液中心无偿献血者标本15份作为正常对照。2、预处理方案:A.环磷酰胺+足叶乙甙+全身照射:B.氟达拉滨+白消安;C.氟达拉滨+白消安+阿糖胞苷;D.环磷酰胺（再生障碍性贫血）。3、GVHD预防:A.亲缘供者:环孢霉素+短程甲氨蝶呤+霉酚酸酯;B.无关供者:环孢霉素+短程甲氨蝶呤+霉酚酸酯+抗胸腺淋巴细胞球蛋白。4、GVHD诊断:根据患者临床表现及病理学检查,依据美国西雅图诊断及分级标准对GVHD进行诊断和分度。5、流式细胞术分析:在移植前后不同时间点采集病人外周血分析CD3+CD4+、CD3+CD8+细胞上LIGHT、HVEM表达的变化,同时检测正常人群LIGHT、HVEM的表达情况。6、ELISA法检测移植病人不同时间点IL-1β、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10等细胞因子的分泌。7、统计学方法:实验结果以均数±标准差表示。采用SPSS11.5软件包,两样本均数比较采用t检验,两个以上样本均数间比较进行One-Way ANOVA。检验水准α=0.05。结果1、所有患者移植后均获造血重建,其中9例发生急性GVHD（Ⅰ～Ⅱ°者6例,Ⅲ～Ⅳ°者3例）,其中供体淋巴细胞输注（DLI）后引起者4例,急性GVHD中位发生时间为19天。7例发生慢性GVHD（局限性1例,广泛性6例）。8例急性GVHD者经过抗GVHD治疗后好转,1例死于Ⅳ°急性GVHD。2、正常人T细胞组成性表达HVEM,不表达LIGHT。LIGHT在CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞分别为（0.94±0.49）%和（1.84±1.07）%;HVEM分别为（13.88±3.68）%和（26.67±6.98）%。3、预处理前、移植后+15天患者T细胞组成性表达HVEM,不表达LIGHT,与正常人群间比较差异无统计学意义,P均＞0.05。预处理前:LIGHT在CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞分别为（1.26±0.5）%和（1.74±0.86）%,HVEM分别为（14±3.73）%和（25.58±4.7）%。移植后+15天:LIGHT分别为（1.34±0.65）%和（2.00±0.93）%,HVEM分别为（12.87±2.16）%和（24.66±4.05）%。4、急性GVHD发生时T细胞LIGHT表达显著上调,HVEM表达下调,与正常人、预处理前、移植后+15天间比较,差异均具有统计学意义,P均＜0.01。LIGHT分别为（18.12±3.36）%和（30.33±5.09）%,HVEM分别为（2.26±1.61）%和（3.44±2.00）%。且Ⅲ～Ⅳ°急性GVHD患者CD3+CD4+T细胞LIGHT/HVEM比值变化较Ⅰ～Ⅱ°者更显著,P＜0.01,CD3+CD8+T细胞LIGHT/HVEM比值变化在两者间差异无统计学意义,P＞0.05。对于DLI引起的急性GVHD与非DLI引起者LIGHT/HVEM比值间差异无统计学意义,P均＞0.05。5、急性GVHD好转后LIGHT、HVEM的表达恢复到移植前水平,与急性GVHD组间比较,差异具有统计学意义,P均＜0.05,同其他组比较差异无统计学意义,P均＞0.05。LIGHT分别为（1.81±0.92）%和（2.58±0.93）%,HVEM分别为（13.54±2.56）%和（23.10±3.17）%。6、慢性GVHD发生时T细胞LIGHT表达明显上调,HVEM表达下调,与急性GVHD组间比较,差异无统计学意义,P均＞0.05,与其他组间差异均有统计学意义,P均＜0.05。LIGHT分别为（16.42±4.31）%和（26.14±4.55）%,HVEM分别为（1.26±0.55）%和（2.70±0.99）%。7、IL-1β在急性GVHD时较急性GVHD组及无急性GVHD组预处理前、移植后+15天明显升高,P均＜0.05,急性GVHD组移植后+15天时TNF-α较其他各组明显升高,P均＜0.05,其余细胞因子在各组各时间点比较,差异均无统计学意义,P均＞0.05。小结急、慢性GVHD发生时T细胞LIGHT表达上调,HVEM表达下调,炎性细胞因子IL-1β、TNF-α表达明显升高,急性GVHD控制后LIGHT、HVEM恢复至移植前水平,上述因素与GVHD的发生、发展相关。第二部分阻断LIGHT-HVEM共刺激通路对T细胞增殖活化影响的研究方法1、分别以C57BL/6小鼠（H-2b）和经25Gy60Co-γ射线照射后的CB6F1小鼠(H-2b/d)脾细胞作为反应细胞和刺激细胞,行初次单向混合淋巴细胞培养,在体系中加入不同浓度的抗小鼠LIGHT单抗（1μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml）,同时以加入抗小鼠IgG单抗（5μg/ml）者为对照组,分别以MTT法和ELISA法检测反应细胞增殖情况及IFN-γ、TNF-α、IL-4等细胞因子分泌情况,按下述公式计算增殖抑制率:（对照组OD—LIGHT单抗组OD）/（对照组OD—空白孔OD）。2、收集初次单向混合淋巴细胞培养的细胞作为反应细胞,以新分离的经照射的CB6F1小鼠脾细胞及C3H小鼠（H-2k）脾细胞作为刺激细胞行再次混合淋巴细胞培养,以MTT法检测反应细胞增殖情况。3、统计学处理:实验结果以均数±标准差或百分率表示,均数间比较进行One-Way ANOVA,两样本率的比较采用x2检验,检验水准α=0.05,所有统计学处理均采用SPSS11.5软件包进行。结果1、初次单向混合淋巴细胞培养体系中加入不同浓度的LIGHT单抗后,反应细胞的增殖能力较IgG单抗对照组明显下降,在低浓度（1μg/ml）时即可发挥抑制作用,其抑制率达29.9%,且随浓度增加其抑制作用增强,当浓度达2.5μg/ml时抑制率达到52.5%,再增加浓度,抑制作用不再增强,LIGHT单抗组同IgG单抗对照组间差异具有统计学意义,P均＜0.05。2、LIGHT单抗组IFN-γ、TNF-α较IgG单抗对照组明显下降,差异具有统计学意义,P＜0.01,而IL-4在两者间比较,差异无统计学意义,P=0.10。LIGHT单抗组IFN-γ（pg/ml）:201.08±21.9 vs IgG单抗对照组412.78±26.12;TNF-α（pg/ml）:LIGHT单抗组524.08±38.4 vs IgG单抗对照组966.15±68.2。3、再次混合淋巴细胞培养时,LIGHT单抗组反应细胞对于已接触过的CB6F1小鼠脾细胞不发生增殖反应,与IgG单抗对照组比较差异有统计学意义,P＜0.01。而当加入未接触过的第三方小鼠脾细胞时,LIGHT单抗组反应细胞增殖能力与IgG单抗对照组间差异无统计学意义,P=0.84。小结体外混合淋巴细胞培养体系中应用LIGHT单抗可抑制反应细胞的增殖及细胞因子分泌,诱导反应细胞对刺激细胞特异性的免疫耐受。第三部分体外阻断LIGHT-HVEM通路诱导供者T细胞特异性免疫耐受对半相合小鼠骨髓移植后急性GVHD的影响方法1、以8周龄的雄性C57BL/6小鼠作为供者,8～12周龄雌性CB6F1小鼠作为受者,建立小鼠半相合骨髓移植急性GVHD模型。受鼠接受60Co-γ射线照射的预处理,总剂量8Gy,剂量率150cGy/min左右,照射后4～6小时内接受5×106供鼠骨髓细胞及6×107供鼠脾脏细胞（事先在体外与受鼠脾脏细胞在LIGHT单抗或IgG单抗存在的情况下共培养72小时）混合后经尾静脉输注给受鼠,观察移植后56天内急性GVHD发生情况及小鼠生存率。2、实验分组如下:（1）PBS组:接受PBS0.5ml/只,n=12;（2）BM组:接受供鼠骨髓细胞5×106/只,n=12;（3）GVHD组:接受供鼠骨髓细胞5×106/只及经IgG单抗处理的供鼠脾脏细胞6×107/只,n=15;（4）LIGHT单抗干预组:接受供鼠骨髓细胞5×106/只及经LIGHT单抗处理的供鼠脾脏细胞6×107/只,n=15。3、统计学处理:实验结果以均数±标准差或百分率（%）表示,均数间比较采用方差分析（One-Way ANOVA）,两样本率的比较采用x2检验,生存分析采用Kaplan-Meier法,检验水准α=0.05,所有统计学处理均采用SPSS11.5软件处理。结果1、PBS组所有动物于照射后+15天内全部死亡,死亡时白细胞＜0.5×109/L;BM组小鼠在观察期56天内全部存活,无急性GVHD表现;GVHD组于+19天开始出现少动、弓背、被毛黄污不光亮,体重下降等aGVHD表现,所有动物在+28天内全部死亡;LIGHT单抗干预组除三只小鼠在+37、38、42天时死于急性GVHD外其余小鼠均存活,无急性GVHD表现。2、在观察期56天内PBS组、BM组、GVHD组及LIGHT单抗干预组生存率分别为:0、100%、0和50%,LIGHT单抗干预组与BM组间生存率差异无统计学意义,P=0.17,而与PBS组、GVHD组间比较差异有统计学意义,P均＜0.01。小结体外阻断LIGHT-HVEM通路诱导供者特异性T细胞免疫耐受后可预防半相合小鼠骨髓移植模型中急性GVHD的发生。结论1、LIGHT-HVEM共刺激通路在临床异基因造血干细胞移植后GVHD的发生、发展过程中起重要作用,在急、慢性GVHD发生时LIGHT表达显著上调,HVEM表达水平下调,当急性GVHD经治疗后好转时LIGHT、HVEM表达水平恢复到正常水平。2、阻断LIGHT-HVEM通路可诱导供者T细胞对已接触过的受者抗原产生特异性免疫耐受,使细胞因子的分泌发生变化,且保留对未接触过的第三方抗原的正常免疫反应能力。3、通过体外阻断LIGHT-HVEM共刺激通路可使半相合小鼠骨髓移植后急性GVHD的发生率大大降低,延长小鼠生存时间。上述研究为通过体外阻断LIGHT-HVEM通路诱导移植免疫耐受,在allo-HSCT中减轻急性GVHD的发生提供了实验依据。