论文题目: 烟草钙依赖型蛋白激酶生化及表达分析
论文类型: 博士论文
论文专业: 发育生物学
作者: 张美
导师: 吕应堂
关键词: 钙依赖型蛋白激酶,磷酸化,原位杂交,胁迫,绿色荧光蛋白,亚细胞定位,烟草
文献来源: 武汉大学
发表年度: 2005
论文摘要: 以玉米MCK1为探针筛选烟草的cDNA文库,得到两个高度同源的全长cDNA序列。本课题就以鉴定这两个cDNA所编码的蛋白质NtCPK4和NtCPK5为中心,开展了一系列的研究。首先分析了这两个蛋白质的氨基酸序列,发现它们编码两个高度同源的钙依赖型蛋白激酶。对于这两个蛋白激酶首先进行了酶活分析,确定其酶活依赖于Ca2+,并进一步分析了它们的酶活动力学常数。用毛细管电泳的方法鉴定了一个蛋白激酶的磷酸化的氨基酸。并对其中的一个基因进行了表达分析,采用的方法是以基因特异的序列为探针进行RNA原位杂交和Northern Blot分析。以GFP为标签,用基因枪转化洋葱表皮进行瞬时表达分析,表明NtCPK4和NtCPK5具有完全不同的亚细胞定位模式,进一步的点突变实验证明了N端可变区在蛋白激酶的亚定位中发挥重要的作用。 1.经序列分析表明,这两个cDNA均含有完整的阅读框,编码的蛋白具有钙依赖型蛋白激酶的保守结构域,即激酶区、自抑制区和钙调素相似区。这两个烟草cDNA所代表的基因分别命名为NtCPK4和NtCPK5,其中编码NtCPK4的cDNA全长为2360bp,包括5’非翻译区、阅读框和3’非翻译区,长度分别为198 bp、1719 bp和443 bp;而NtCPK5的cDNA全长为2368 bp,其5’非翻译区、阅读框和3’非翻译区长度分别为247bp、1704 bp和417 bp。进化树分析表明这两个蛋白激酶（NtCPK4和NtCPK5）在进化上处于CPK和CRK之间。 2.为了在生化上鉴定该激酶是钙依赖型蛋白激酶,本实验采用昆虫细胞表达系统表达了烟草的NtCPK4和NtCPK5蛋白,纯化蛋白后进行了激酶活性分析。结果表明这两个蛋白激酶在以histone Ⅲs为底物时,它的自磷酸化以及底物磷酸化的活性都是钙依赖性,可以快速的发生磷酸化。激酶的动力学曲线分析表明:在histone Ⅲs为底物的条件下,NtCPK4的Vmax是588 nmol min-1。mg-1,Km值为176 μg ml-1,在syntide-2为底物的条件下,NtCPK4的Vmax是2415 nmol min-1mg-1,Km值为58 μM。而NtCPK5在histone Ⅲs为底物的条件下,NtCPK4的Vmax是526 nmol min-1mg-1,Km值为210μg
论文目录:
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本论文缩略词表
目录
第一章 前言
第一节 Ca~(2+)信号通路简介
一.引言
二.Ca~(2+)信号的起始
1.Ca~(2+)通透性通道
2.通过H~+／Ca~(2+)反转运子或Ca~(2+)／ATP酶介导的胞质环流系统的Ca~(2+)流动
3.CaL~(2+)泵
二.钙信号的解码
1.钙调素(CaM)及钙调素结合蛋白
2.其他CaM相似的含有EF-Hand的Ca~(2+)结合蛋白
3.Ca~(2+)调节的蛋白激酶
4.不含EF-Hand的Ca~(2+)结合蛋白
三.钙信号的特异性决定
1.亚型一特异的Ca~(2+)活化机制
2.磷酸化调节
3.磷脂调节
4.亚细胞定位和亚型特异的复合体
5.底物特异性
四.Ca~(2+)信号研究展望
第二节 植物CPK超家族蛋白激酶
一.引言
二.CPK超家族成员的分类和结构特征
1.钙依赖型蛋白激酶CPK
2.钙调素依赖型蛋白激酶CaMK
3.嵌合型钙／钙调素依赖型蛋白激酶CCaMK
4.钙依赖性蛋白激酶相关蛋白激酶CRK
三.CPK超家族成员的生化特征
1.钙依赖型蛋白激酶
2.钙调素依赖型蛋白激酶
3.钙／钙调素依赖型蛋白激酶CCaMK
4.钙依赖性蛋白激酶相关蛋白激酶CRK
四.植物CPK研究进展
1.CPK的酶活性调节
2.调控及生理功能
五.研究展望
第三节 本项研究的目的和意义
第二章 烟草钙依赖型蛋白激酶基因的克隆及序列分析
第一节 前言
第二节 材料和方法
一.文库的筛选
二.序列的测定
三.序列的同源性比较
四.序列的结构分析
第三节 实验结果
一.NtCPK4和NtCPK5序列的分析
二.NtCPK4和NtCPK5同其它蛋白激酶氨基酸序列的比较分析
第四节 讨论
第三章 烟草钙依赖型蛋白激酶体外表达、纯化及酶活分析
第一节 前言
第二节 材料和方法
一.实验材料与质粒图谱
二.NtCPK4和NtCPK5昆虫细胞表达载体构建
三.重组蛋白质的纯化
四.NtCPK4和NtCPK5蛋白激酶酶活分析
五.毛细管电泳分析磷酸化氨基酸
第三节 实验结果
一.NtCPK4的表达纯化以及生化分析
二.NtCPK4磷酸化氨基酸分析
三.NtCPK5的表达纯化以及生化分析
第四节 讨论
一.Sf9细胞的培养及病毒的感染
二.蛋白的纯化
三.激酶的自磷酸化和底物磷酸化分析
四.酶活常数的测定
五.磷酸化氨基酸的分析
第四章 烟草钙依赖型蛋白激酶表达及功能分析
第一节 前言
第二节 材料和方法
一.烟草基因组DNA的提取
二.Southern Blot
三.Northern Blot
四.RNA原位杂交分析
第三节 实验结果
一.NtCPK4基因是一个单拷贝基因
二.烟草NtCPK4的表达分析
第四节 讨论
一.RNA原位杂交技术进展
二.NtCPK4参与胁迫信号和激素信号转导
第五章 烟草钙依赖型蛋白激酶的亚细胞定位分析
第一节 前言
第二节 材料和方法
一.载体的构建
二.转化洋葱表皮与荧光观察
第三节 实验结果
一.NtCPK4和NtCPK5的亚细胞定位特征
二.突变后的NtCPK5／GFP的亚细胞定位特征
第四节 讨论
一.GFP作为小分子标记的优点
二.CPK研究亚细胞定位的进展
第六章 总讨论
第一节 关于CPK基因进化的讨论
第二节 关于CPK的研究展望
参考文献
附录
在读期间发表及投稿论文
致谢
发布时间: 2006-03-27
参考文献
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