论文摘要
创伤会导致机体的靶细胞严重损伤,同时由于感染所致的脓毒症及非感染所致的全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome,SIRS）相互作用使得自体修复功能障碍,并进一步造成微血管损伤、微循环障碍,从而引起重要脏器功能障碍,这可能就是器官功能障碍（multiple organ dysfunction syndrome,MODS）的始发环节。而MODS是重症监护病房（intensive care unit,ICU）患者死亡的最常见原因。近年来研究表明:骨髓中有一群能够在生理性或病理性因素的刺激下,动员到外周血并分化为成熟内皮细胞（Endothelium cell,EC）以促进血管新生,并可以分化为相应的组织细胞进行损伤修复的祖细胞,这些细胞被称为内皮祖细胞（Endothelialprogenitor cell,EPC）。EPC过去被认为是胚胎时期血管新生最主要的细胞,而越来越多的证据显示EPC也是出生后生理性及病理性血管形成最主要的细胞,并参与心、肝、肺、肾等单个器官障碍时的修复;同时迁徙到损伤部位的EPC还可以对不同的局部刺激（包括缺氧或缺血）作出生理反应,依次释放血管活性物质、生长因子以及参与免疫调节的细胞因子和趋化因子,参与创伤后的炎症反应。目前研究认为EPC主要有2类:一类是来源于骨髓和刚被动员进入外周循环的早期EPC,它们都表达三种祖细胞分子标志:CD133（AC133）、CD34和血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2、KDR或Flk-1）,而不表达VE-钙黏素（VE-cadherin）和血小板内皮细胞粘附分子-1（CD31）;另一类是晚期EPC:即早期EPC释放入外周血循环或经体外培养后则逐渐失去CD133和CD34表达等祖细胞特性,并开始表达内皮系的特征性分子标志:CD31和KDR等,同时可吞噬乙酰化低密度脂蛋白（Ac-LDL）和荆豆凝集素（UEA-1）。CD133和KDR是造血干细胞和内皮细胞的重要标志,在胚胎早期血管也有表达,因而通常被用作为识别EPC的标志之一。目前国内外对EPC的分离和体外培养方法尚未达成一致,本实验根据国内外文献的比较以及实验中的归纳总结,以密度梯度法分离小型猪骨髓中单个核细胞,并通过体外经VEGF等生长因子诱导培养后得到EPC;并对培养出的EPC进行细胞形态学;细胞表型;细胞增殖特征;体外血管形成功能及细胞吞噬Ac-LDL和UEA-1来进行鉴定。本研究显示,EPC可以在机体发生MODS后向不同组织迁徙或归巢,发挥组织修复作用,并通过毛细血管的新生以改善创伤后缺血缺氧引起的脏器功能障碍,自体移植EPC可以降低MODS的发生率,并改善MODS的预后。为此,本文从EPC对自体修复的角度出发,探讨MODS发病机理及自体移植EPC预防和治疗MODS的理论依据。本研究共分为四部分,首先通过内毒素+失血性休克制造出MODS的动物模型,并在MODS的各个阶段进行外周血中EPC的监测,同时在体外建立起EPC培养和鉴定体系,将体外培养增殖的自体EPC移植入MODS的动物,观察移植后MODS的发生率和重要脏器的功能改善情况,评价自体移植EPC防治MODS的效果,并对其作用机制进行初步探讨。第一部分多器官功能障碍动物模型的建立在本研究的第一部分我们首先成功地复制了双相迟发型的猪MODS模型,将为研究自体移植内皮祖细胞防治创伤后多器官功能障碍的作用提供了实验的基础。将体重25～30 Kg健康雄性家猪随机分为2组:实验组（MODS）10只,施行失血性休克+内毒素血症复合因素;对照组（C）9只,施行假手术,予以股动静脉置管,不实施失血及内毒素注射。用自动分析仪检测WBC、GRAN、SALT、SAST、Cr、BUN、动脉血氧分压（PaO2）,以上各指标采用自身对照,以判断器官功能,主要器官病理形态学检查（大体、光镜）。结果显示实验组WBC、GRAN、SALT、SAST、Cr、BUN均明显升高,动物死亡前显著高于正常值,PaO2明显下降。病理学改变主要表现为衰竭器官呈以炎症为主的非特异性改变。实验组MODS发生率为90%,死亡率为80%,显著高于对照组。本实验采用二次打击,与临床实际相符,且MODS的发生率及死亡率均高,操作简单,容易复制,是一个较成功的动物模型。第二部分外周循环中内皮祖细胞在MODS各个阶段的数量和功能变化及意义本部分通过监测MODS各个阶段,外周循环中内皮祖细胞的数量和功能变化,旨在为自体移植内皮祖细胞防治MODS奠定理论的基础同时确定最佳的自体移植时间。按照上述方法造模后,分别在正常状态下、手术后、失血后2小时、血液回输后2小时、输注内毒素后1小时、12小时、24小时、48小时、96小时取外周血。以密度梯度法分离出单个核细胞（PMC,peripheral mononuclear cells）,对其进行CD133和CD34双重标记,CD133+和KDR+双标记阳性者被认为是外周血中的EPC,并通过流式细胞仪技术对EPC进行计数。同时取外周血中以密度梯度法分离出的PMC按照1×106/cm2的密度接种于培养皿内,培养96小时后,进行细胞增殖、贴壁、迁徙和血管形成功能的测定,比较不同时间点外周血中EPC的功能变化。结果显示:在MODS的形成过程中,外周循环中EPC较正常组外周循环中EPC数量先增加随后出现明显的下降,并且其增殖、黏附、迁移和血管形成功能较正常组明显减退,说明MODS的发生和发展过程中的炎症的不断加重对EPC数量及功能具有明显的影响作用,同时由于EPC数量及功能出现明显的下降,导致重要的脏器功能损伤。第三部分小型猪骨髓内皮祖细胞的体外培养、鉴定和功能检测本部分旨在建立起小型猪骨髓EPCs的标准化分离、培养、扩增和鉴定的方法,为自体移植内皮祖细胞防止MODS提供合理的技术平台。用密度梯度离心法从猪骨髓中分离出BMMC,按照1×105/cm2的密度接种于培养皿内,使用添加了细胞因子和胎牛血清的内皮祖细胞专用培养液进行诱导分化培养,在固定时间进行消化、传代和扩增。同时,观察培养27天时P6代EPC的生长情况,并对其进行细胞形态学特征、细胞的超微结构、免疫组化、流式细胞仪技术、乙酰化的低密度脂蛋白（Dil-Ac-LDL）和荆豆凝集素-1（FITC-UEA-1）的吞噬功能、体外血管生成功能鉴定,为后文的自体移植做准备。结果显示:培养48小时后逐渐出现梭形贴壁细胞（attaching cells,AT cells）,并出现成簇现象,培养第6天时的EPC,已经开始出现成集落的贴壁细胞。在电镜下观察细胞;细胞内可检测到典型的Weibel-Palade小体。超过85%体外培养的贴壁细胞都特异性地摄取了Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1。在免疫组化鉴定:CD133（+）,CD34（+）,CD31（++）,KDR（++）。流式细胞仪技术鉴定:CD133的阳性率:18.23±7.12%;CD34的阳性率:47.71±14.85%;CD31的阳性率:71.61±13.51%;KDR的阳性率:87.24±11.40%。体外血管生成功能提示:细胞在特殊的细胞培养环境中可以生成新生的血管。第四部分自体移植内皮祖细胞防治创伤后多器官功能障碍的研究本部分旨在探讨自体移植骨髓EPC对小型猪创伤后多器官功能障碍治疗的有效性和安全性的研究,同时比较不同数量EPC进行移植治疗的疗效差异。预先抽取实验动物骨髓,按照前述的方法进行EPC的分离、培养和扩增。后按照前述方法造模,将达到MODS的动物随机分为三组,分别按照1×106个细胞/Kg体重（低剂量移植组、LT组,8只）和1×107个细胞/Kg体重（高剂量移植组、HT组,8只）进行自体EPC移植治疗,同时以未行任何干预的MODS（M组,10只）作为对照组。结果显示:低剂量移植组（LT）实验动物MODS的发生率和死亡率分别为（75%;6/8、75%;6/8）明显高于高剂量移植组（HT）实验动物（50%;4/8、37.5%;3/8）,但低于单纯MODS组（90%;9/10、80%;8/10）（P＜0.01）;同时LT组实验动物的生存时间（78.47±44.12小时）也较HT组实验动物（156.18±72.87小时）明显缩短。LT组实验动物在MODS各个阶段的WBC、GRAN、SALT、SAST、Cr、BUN均高于HT组,但较单纯MODS组略有降低。提示自体移植内皮祖细胞可以有效的促进创伤后的修复,防止MODS的发生和发展,同时可改善MODS动物的预后以及延长生存时间。结论:体内EPC的数量减少及功能障碍可能是MODS发生发展的重要原因之一,自体移植内皮祖细胞可以在机体发生MODS后向不同组织迁徙或归巢,发挥组织修复作用,并通过毛细血管的新生以改善创伤后缺血缺氧引起的脏器功能障碍,防止MODS的发生和发展,同时可改善MODS动物的预后以及延长生存时间。