论文摘要
目的:肿瘤是严重影响人类健康的重大疾病之一,胰腺癌是最常见的消化系统肿瘤,也是临床预后最差的肿瘤之一,早期不易被发现,晚期常有淋巴结转移,尚缺乏理想的治疗方法。近年来,生物治疗已成为肿瘤治疗的一种新模式,其中免疫基因治疗是肿瘤生物治疗的研究热点,通过将不同免疫分子基因导入肿瘤或免疫效应细胞,使其在机体表达并分泌细胞因子,促进肿瘤细胞的凋亡或通过增强免疫系统功能,以加速肿瘤的消退。白细胞介素27（IL-27）是2002年Pflanz报道的一种IL-6/IL-12家族细胞因子[1],主要作用于固有免疫和适应性免疫系统的多种细胞,发挥广泛的免疫调节作用。除了在Th1反应中起重要作用外,还具有抗感染、抗肿瘤、诱导炎症反应等多种生物学活性[2],但有关IL-27的作用机理等许多问题还有待于进一步研究。本研究将IL-27基因转染人胰腺癌细胞（Aspc1）,建立荷瘤裸鼠模型,探讨了IL-27的抗肿瘤作用机制。方法:1 IL-27基因转染细胞株的建立以逆转录病毒为载体,将IL-27基因转入人胰腺癌细胞（Aspc1）,同时,将LXSN空载体转染Aspc1细胞作为对照组细胞,用G418筛选转染细胞。2用光学显微镜观察Aspc1/IL-27、Aspc1/LXSN和Aspc1细胞的形态变化,RT-PCR检测IL-27基因的表达,ELISA法检测细胞培养上清中IL-27的分泌。3 IL-27诱导干扰素-γ（IFN-γ）的产生ELISA法检测细胞培养上清诱导人外周血单个核细胞（human peripheral blood mononuclear cells,hPBMCs）分泌IFN-γ和IL-4水平。4细胞增殖实验用MTT法检测细胞Aspc1/IL-27、Aspc1/LXSN和Aspc1细胞的体外增殖反应能力,绘制生长曲线。5用流式细胞技术检测不同Aspc1细胞表面分子CD80、CD86和MHCI、MHCII类分子的表达情况。6动物模型的建立将Aspc1/IL-27、Aspc1/LXSN和Aspc1细胞接种于裸鼠皮下,观察三组细胞在裸鼠体内的成瘤性、生长情况和裸鼠的生存期,用RT-PCR方法来检测祼鼠肿瘤组织中IL-27的表达,ELISA法检测各组裸鼠脾细胞分泌IFN-γ的能力。7细胞凋亡分析采用流式细胞技术检测Aspc1/IL-27细胞在体外和接种于祼鼠体内的细胞凋亡情况,并用电子显微镜观察细胞凋亡的超微结构变化。8 Fas和Survivin的表达用RT-PCR法检测Aspc1/ IL-27、Aspc1/LXSN和Aspc1三组细胞在裸鼠体内移植瘤组织中Fas和Survivin基因表达变化;采用Western-blot法来检测其在蛋白水平表达变化。结果:1将IL-27和空载体LXSN基因分别转染Aspc1细胞,经G418筛选,获得表达IL-27的阳性细胞克隆Aspc1/ IL-27和空载体对照细胞Aspc1/LXSN。光镜下观察转染IL-27基因后的Aspc1/IL-27细胞与野生型Aspc1和Aspc1/LXSN细胞形态学无明显变化;RT-PCR分析结果显示,Aspc1/IL-27细胞有IL-27p28和IL-27EBI3基因的表达;ELISA检测结果显示,Aspc1/IL-27细胞培养上清中可检测出高水平IL-27,而Aspc1/LXSN和Aspc1细胞未见IL-27表达。从而在基因和蛋白水平证明,成功建立了转染IL-27基因的人胰腺癌细胞株。2 Aspc1/IL-27细胞培养上清可刺激hPBMCs产生IFN-γ,IFN-γ水平明显高于Aspc1/LXSN和Aspc1细胞（P<0.01）,然而,IL-4水平在三种细胞间无显著变化（P>0.05）。3 Aspc1/IL-27细胞的体外增殖反应与Aspc1/LXSN和Aspc1细胞无明显差别（P>0.05）。4 Aspc1/IL-27、Aspc1/LXSN、Aspc1细胞表面CD80、CD86和MHCI类、MHCII类分子的表达水平无显著性差异（P>0.05）。5 Aspc1/IL-27细胞在裸鼠体内的生长速度较Aspc1和Aspc1/LXSN细胞明显减慢（P<0.01）,且接种Aspc1/IL-27细胞组裸鼠的生存期也明显长于接种Aspc1/LXSN和Aspc1细胞组（P<0.01）。接种Aspc1/IL-27细胞组裸鼠脾细胞分泌IFN-γ水平明显高于接种Aspc1/LXSN和Aspc1细胞组（P<0.01）。6 Aspc1/IL-27、Aspc1/LXSN、Aspc1三种细胞的体外凋亡率无明显差异（P>0.05）;而在接种裸鼠后,Aspc1/IL-27移植瘤组织细胞的凋亡率明显高于Aspc1/LXSN和Aspc1细胞组（P<0.01）;电子显微镜下观察,Aspc1/IL-27细胞移植瘤组织出现明显的细胞凋亡形态学改变。7接种Aspc1/IL-27细胞裸鼠移植瘤组织较接种Aspc1/ LXSN与Aspc1细胞组Fas表达水平升高（P<0.01）,Survivin表达水平下降（P<0.01）。结论:成功建立转染IL-27基因的胰腺癌细胞株（Aspc1/ IL-27）,转染IL-27基因对Aspc1细胞体外生长无明显影响;Aspc1/IL-27细胞分泌的IL-27能够诱导hPBMCs分泌IFN-γ;在裸鼠体内可通过降低移植瘤组织中Survivin的表达,上调Fas的表达,诱导Aspc1细胞凋亡,产生抗肿瘤作用。
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