华根霉（Rhizopus chinensis）脂肪酶的基因克隆、表达，纯化和酶学性质研究

论文摘要

生物催化在工业应用的过程中,一个很大的限制因素就是催化剂脂肪酶。自然条件下,菌株产脂肪酶量较低,利用常规育种方法难以满足工业化生产的需要。本论文从华根霉（Rhizopus chinensis）CCTCCM201021中首次克隆得到其脂肪酶全基因,并实现了华根霉脂肪酶前导肽和成熟肽在巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）中的高水平分泌表达,初步分离纯化后对比了两重组脂肪酶的酶学性质差异,为华根霉脂肪酶的进一步理论研究及其应用奠定了基础。主要研究结果包括:（1）以实验室保藏菌种华根霉基因组为模板,利用根霉通用引物PCR扩增得到华根霉18S rDNA片段,鉴定其种属。根据Rhizopus stolonifer和Rhizopus oryzae脂肪酶基因序列比对后设计调取华根霉脂肪酶基因的引物,利用两次PCR程序分别获得华根霉脂肪酶上、下游片段,拼接后得到华根霉脂肪酶全基因（RCL）。该基因的开放阅读框长1170 bp,不含内含子,编码一个389个氨基酸残基的蛋白质。包括26个氨基酸的信号肽,94个氨基酸的前导序列和269个氨基酸的成熟肽,其推断的氨基酸序列与一些已报道的根霉脂肪酶序列同源性为86%。（2）构建酵母分泌型表达重组质粒pPIC9k-proRCL和pPIC9k-mRCL,将重组表达质粒线性化后电转化巴斯德毕赤酵母。构建了GS115/pPIC9k-proRCL用于分泌表达前导肽脂肪酶,表型包括His+Muts和His+Mut+;构建了GS115/pPIC9k-mRCL用于分泌表达成熟肽脂肪酶,表型包括His+Muts和His+Mut+。SDS-PAGE分析表达的慢生型前肽脂肪酶的分子量为37 kD左右,最大分泌表达量为0.85 mg/mL,占分泌蛋白总量的68.3%, pNPP法测得此时的脂肪酶水解活力为121.2 U/mL;表达的慢生型成熟肽脂肪酶的分子量为30 kD左右,最大分泌表达量为0.16 mg/mL,占分泌蛋白总量的21.6%,pNPP法测得此时的脂肪酶水解活力为4.3 U/mL。（3）将重组巴斯德毕赤酵母GS115/pPIC9k-proRCL Muts和GS115/pPIC9k-mRCL Muts发酵上清液经过10 KD超滤膜浓缩,SP-Sepharose FF强阳离子交换层析和Phenyl-Sepharose 6 FF疏水色谱柱层析后得到脂肪酶活性组分proRCL和mRCL。纯化后的重组蛋白proRCL N-端氨基酸测序分析表明该重组脂肪酶是加工过的产物,分泌表达的重组脂肪酶只保留了前导序列C-端的27个氨基酸和成熟肽的269个氨基酸,简称pro27RCL。酵母菌GS115/pPIC9k-pro27RCL和GS115/pPIC9k-mRCL的表达上清液在用Endo H处理前与处理后其蛋白分子量没有发生变化,表明该酵母表达的重组脂肪酶都未进行N端糖基化修饰。（4）通过对重组脂肪酶pro27RCL和mRCL的酶学性质研究,发现pro27RCL和mRCL的最适反应pH和最适反应温度相近,最适pH值分别为8.5和8.0,最适反应温度分别为40℃和35℃。但底物选择性和动力学常数差异较大。pro27RCL对C6-C8中链脂肪酸酯水解活力较高,而mRCL对pNPC2的水解活力最高,对C2-C6的短链脂肪酸酯水解活力较高,分类学上更倾向于酯酶（Esterase E.C.3.1.1.2）。两脂肪酶对对硝基苯酚棕榈酸酯的Km和Vmax分别为0.304 mmol/L、0.345 mmol/L和3.38μmol/min/mL、0.074μmol/min/mL。pro27RCL和mRCL对三油酸甘油酯均没有位置选择性。10 mmol/L的Ca2+、Mg2+对两重组脂肪酶均有较好的激活作用,而Hg2+、SDS和PMSF强烈抑制两酶的活力。它们在正己烷、正庚烷和异辛烷（30% v/v）中具有较高的活力和良好的稳定性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 立题意义
• 1.2 国内外研究进展
• 1.2.1 脂肪酶重组菌的研究现状
• 1.2.2 巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展
• 1.2.3 根霉脂肪酶的纯化及立体结构
• 1.2.4 根霉脂肪酶的应用
• 1.3 本课题研究思路和内容
• 1.3.1 课题研究思路
• 1.3.2 研究方法
• 1.3.3 研究内容
• 第二章 华根霉脂肪酶基因的克隆和序列分析
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌株与质粒
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 培养基与溶液
• 2.2.4 主要仪器
• 2.2.5 实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 华根霉基因组DNA 的获得
• 2.3.2 华根霉18S rDNA PCR 扩增产物的电泳鉴定
• 2.3.3 克隆质粒的构建
• 2.3.4 华根霉18S rDNA 基因序列及其系统进化树
• 2.3.5 RCL 基因序列的获得
• 2.3.6 克隆质粒的构建
• 2.3.7 RCL 全基因序列及其蛋白序列
• 2.3.8 RCL 模拟三维结构分析
• 2.4 本章小结
• 第三章 表达质粒的构建和在毕赤酵母（Pichia pastoris）中的表达
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌株与质粒
• 3.2.2 主要试剂
• 3.2.3 培养基与溶液
• 3.2.4 主要仪器
• 3.2.5 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 前导序列 proRCL 和成熟脂肪酶 mRCL 基因的克隆
• 3.3.2 pPIC9k-proRCL 和pPIC9k-mRCL 表达质粒的构建与鉴定
• 3.3.3 脂肪酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 第四章 重组蛋白的分离纯化
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌株
• 4.2.2 主要试剂
• 4.2.3 培养基与溶液
• 4.2.4 主要仪器
• 4.2.5 实验方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 脂肪酶的分离纯化
• 4.3.2 酶的分子量
• 4.3.3 重组脂肪酶 proRCL 和 mRCL 的分离纯化结果
• 4.3.4 重组脂肪酶 proRCL N-端氨基酸序列分析
• 4.4 本章小结
• 第五章 重组脂肪酶酶学性质研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 实验方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 pH 对重组脂肪酶活力的影响
• 5.3.2 pH 对重组脂肪酶稳定性的影响
• 5.3.3 温度对重组脂肪酶活力的影响
• 5.3.4 温度对重组脂肪酶稳定性的影响
• 5.3.5 重组脂肪酶的脂肪酸链长专一性
• 5.3.6 重组脂肪酶的位置选择性
• 5.3.7 不同化合物对重组脂肪酶活力的影响
• 5.3.8 重组脂肪酶的有机溶剂稳定性
• 5.3.9 重组脂肪酶的动力学常数
• 5.3.10 N-端糖基化分析
• 5.4 本章小结
• 主要结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的论文清单