水稻热激蛋白Hsp90基因的克隆及互作蛋白的筛选

论文摘要

逆境胁迫（如低温、高温、干旱、高盐等）会引起植物体内发生一系列的生理反应,表现为代谢和生长的可逆性抑制,严重时甚至引起不可逆伤害,导致整个植株死亡。在逆境条件下,植物可以利用体内的一些已有蛋白或新合成的一些蛋白,来维持正常条件下才能进行的一些新陈代谢。由于这些蛋白对植物度过逆境具有非常重要作用,因此通称为植物逆境蛋白,是当今分子生物学、蛋白质组学和植物抗逆生理的一个重要研究内容,其中心问题是逆境蛋白的生物学功能。近年来,随着分子生物学理论和技术的渗透,逆境蛋白的研究有了很大进展,一些编码逆境蛋白的基因已被分离。全面深入地认识逆境蛋白的生理机理,准确掌握逆境蛋白在植物体内的理化性质及生物学功能,将有助于了解植物对逆境的适应机制,对植物抗逆品种的筛选和培育等具有指导意义。热激蛋白（Heat Shock Protein,Hsp）是一类在逆境胁迫特别是高温胁迫诱导下,生物体内生成的高度保守的逆境蛋白家族,是目前发现的主要分子伴侣蛋白之一,直接参与并促进细胞内蛋白质从初生链的合成到多亚基复合体折叠、装配等整个生物过程。目前,Hsp在动物中研究居多,而植物中研究较少。本研究主要以水稻热激蛋白Hsp90作为研究对象,利用酵母双杂交系统筛选其互作蛋白,为进一步研究OsHsp90的功能,尤其是作为分子伴侣的作用机制打下基础。主要研究结果如下:1、采用荧光差异显示（Fluorescent Differential Display,FDD）技术,比较分析了高温处理与未处理的水稻根、叶鞘和叶中的mRNA表达,并利用H.A.Yellow-PAGE（含0.1%H.A.Yellow）再分离与大矩阵筛选相结合的方法,发现一个水稻热激蛋白Hsp90差异片段。经RACE-PCR克隆其cDNA全长,拥有2408 bp碱基,编码一个具有699 AA残基的多肽,其中,第26—35 AA残基是Hsp90家族的保守序列,第28—182 AA残基是一个ATPase结构域,第185—699 AA残基是Hsp90结构域,命名为OsHsp90（GenBank登录号为AB111810）。2、利用酵母双杂交系统筛选OsHsp90的互作蛋白,特别是筛选结合位点位于ATPase结构域之外区域的互作蛋白。经严格筛选,共得到13个阳性菌落。其中结合位点位于ATPase结构域之后区域的有3个。测序后经氨基酸序列比对,共发现4个互作蛋白:（1）富含脯氨酸蛋白（rice proline rich protein,OsPRP）,含416 AA残基,第54—412 AA残基是一个富含脯氨酸区域;（2）氨甲酰磷酸合成酶核蛋白体（rieeputative earbamoyl phosphate synthetase small subunit）,含462 AA残基,第75—222 AA残基为氨甲酰磷酸合成酶结构域,第261—462AA残基为谷氨酰胺转移酶Ⅰ结构域;（3）转氨酶Ⅳ（rice aminotransferaseⅣ）,包含361 AA残基,第244—273 AA残基是转氨酶Ⅳ的保守序列,第68—343 AA残基是转氨酶Ⅳ结构域,且该蛋白在OsHsp90的ATPase结构域之后区域存在结合位点;（4）一个水稻推定蛋白,未发现任何已知功能域存在,功能未知。3、根据筛选出的互作蛋白的特点,初步讨论了OsHsp90在其互作蛋白发挥主要生理功能的过程中可能起到的作用。

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摘要

Abstract

第一章文献综述

第一节植物逆境生理

1 高温胁迫对植物的影响

1.1 高温胁迫抑制植物生长发育

1.2 高温胁迫破坏细胞膜结构

1.3 高温胁迫抑制光合作用和呼吸作用

1.4 高温胁迫造成植物外观形态变化

2 其他逆境胁迫对植物的影响

2.1 低温胁迫对植物的影响

2.2 干旱胁迫对植物的影响

2.3 高盐胁迫对植物的影响

第二节植物热激蛋白研究进展

1 Hsp的发现

2 Hsp的分类

3 Hsp的结构上特点

4 Hsp的主要功能

4.1 Hsp具有分子伴侣的功能

4.2 Hsp提高植物的耐热性

4.3 Hsp与植物的耐冷性

5 Hsp90及其ATPase结合域

第三节酵母双杂交系统介绍

1 酵母双杂交原理

2 酵母双杂交系统的特点

3 酵母双杂交系统的缺陷及改进

4 本文选用的酵母双杂交系统

第四节本研究的目的及意义

第二章水稻热激蛋白（OsHsp90）基因的克隆及GST融合蛋白表达

1 实验材料

2 实验方法

2.1 水稻RNA提取及纯化

2.1.1 所需试剂及器皿

2.1.2 RNA提取步骤

2.1.3 RNA纯化步骤

2.2 mRNA差异显示及基因片段克隆

2.3 DNA片段的连接

2.4 连接产物的转化

2.4.1 感受态细胞的制备

2.4.2 转化步骤

2.5 阳性克隆的筛选

2.6 测序质粒DNA的制备以及PCR反应等准备

2.7 序列测定及分析

2.8 cDNA全长的RACE克隆

2.9 构建GST-OsHsp90质粒

2.10 SDS-PAGE检测融合蛋白表达

3 结果与分析

3.1 OsHsp90的基因序列分析

3.2 OsHsp90的相似性分析

3.3 OsHsp90的GST融合蛋白表达

第三章利用酵母双杂交系统筛选OsHsp90的互作蛋白

1 实验材料

1.1 材料及菌株

1.2 试剂及仪器

2 实验方法

2.1 目的片段的获得

2.1.1 设计引物

2.1.2 PCR扩增基因片段

2.1.3 测序确认目的条带

2.2 构建GAL4 DNA-BD融合基因

2.2.1 双酶切质粒和载体

2.2.2 连接、转化、筛选阳性克隆

2.2.3 水煮法大量提取质粒DNA

2.3 检测DNA-BD融合基因的自身转录活性

2.3.1 酵母感受态细胞的制备

2.3.2 酵母转化

2.3.3 分析结果

2.4 检测诱饵蛋白对酵母的毒性

2.5 酵母共转化

2.6 测序确认编码互作蛋白的基因

3 实验结果与分析

3.1 诱饵蛋白的自身转录活性检测

3.2 诱饵蛋白毒性检测

3.3 筛选结果分析

3.3.1 OsHsp90互作蛋白筛选结果及分析

3.3.2 筛选结合位点位于OsHsp90 ATPase结构域之后区域的互作蛋白结果及分析

第四章总的结论及讨论

参考文献

致谢

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