纳米银组织工程外周神经支架对坐骨神经缺损修复的实验研究

论文摘要

周围神经缺损的修复一直是神经科学的一大难题,自体神经移植是临床上修复神经缺损常用的方法,但自体神经来源有限,难于在临床上开展应用。而异体神经或异种神经更受到免疫排斥反应的限制。近年来,应用组织工程技术构建具有良好生物相容性的支架材料修复外周神经损伤成为研究的热点。应用神经修复支架桥接神经两断端,引导神经轴突轴向生长,避免神经瘤的形成,为神经再生提供一个相对隔绝的微环境。理想的组织工程化周围神经必须具备三个基本要素:①支架:是神经轴突黏附和爬行的临时性支持结构;②种子细胞或蛋白:是促进和引导周围神经功能性再生的主要成份;③构建技术:使种子细胞或蛋白与支架完美结合,使它们的作用能够最大化,并最终替代缺失的组织。本研究以I型胶原和明胶为主要原料,并加入纳米银颗粒,通过冷冻干燥技术制备具有轴向排列微管结构的纳米银――胶原蛋白支架材料。微管直径在20—80μm,使其不仅在组成成份上,更在三维结构上高度仿生神经。这种轴向排列的微管结构,有利于引导再生轴突定向生长。材料内部均匀分布的纳米银颗粒在湿润的体内环境中表面携带正电荷,可以直接和神经细胞表面带负电的基团相互作用,有利于神经细胞的黏附。同时正电荷离子还可以吸附细胞外基质蛋白在材料内表面均匀分布,以模拟雪旺细胞基底膜对神经再生的引导作用,从而加速外周神经在支架中的修复再生过程。实验第一部分是使用I型胶原和明胶为支架原料,与不同浓度纳米银溶液混合,通过冰冻干燥技术制得多组纳米银――胶原蛋白支架。通过扫描电镜观察其内部孔径排列和机械强度测试,选取最具有仿生结构和具有较强机械强度的纳米银――胶原蛋白支架。将最优纳米银含量的胶原蛋白支架分别在体内进行降解实验和银颗粒蓄积毒性的实验,在体外进行抗菌性实验。以证明纳米银――胶原蛋白支架具有良好的抗菌性能及无细胞毒性和无体内蓄积毒性。结果证实:1.通过冷冻干燥技术制备的纳米银――胶原蛋白支架为圆柱状,其中当纳米银浓度在0～4mg/ml之间支架材料内部结构较为理想。扫描电镜观察横切面显示微管内径较均一,孔径在20～80微米,为轴向平行排列,与周围神经结构相似,可以为神经轴突的再生提供仿生引导通道。而当纳米银溶液浓度大于4mg/ml时,支架材料内部微管直径不均匀,并伴随有大量实心部分的出现,不能为神经轴突的穿行提供仿生的微环境。2.使用含不同浓度纳米银(0～4mg/ml)的纳米银――胶原蛋白支架进行微拉伸强度测试。结果含不同浓度纳米银的胶原蛋白支架在充分浸湿的情况下均能抵抗一定强度的拉伸力。根据拉伸强度公式:微拉伸强度(MPa)=最大断裂载荷(N)/材料横截面积(mm2)计算各浓度组支架材料的拉伸强度。其中含纳米银浓度为(0～2mg/ml)的胶原蛋白支架抗拉伸强度无显著差异,达到0.212～0.22MPa。而其余浓度组抗拉伸强度随纳米银含量的增加而明显下降。3.将4组含不同浓度纳米银(0～2mg/ml)的胶原蛋白支架制成薄膜状贴覆于96孔板底面,每组10孔。对照组10孔不添加。将雪旺细胞悬液均匀接种于96孔板。使用MTT法检测实验组与对照组每日吸光度值,以时间为横轴,光吸收值为纵轴绘制生长曲线。结果显示4组实验组与对照组雪旺细胞生长曲线在各观察时间点基本重合。证实了实验组与对照组雪旺细胞生长状态无明显差异,纳米银所含浓度不同均对雪旺细胞无细胞毒性。4.按照琼脂筛选平板法将金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和大肠杆菌标准菌落以0.5麦氏单位在筛选平皿上进行点种,后将2实验组纳米银――胶原蛋白支架(含纳米银分别为2mg/ml和1mg/ml)与不含纳米银的普通胶原蛋白支架分别贴覆在平皿中心,置于37℃培养箱中孵育24h后观察发现2mg/ml组的纳米银――胶原蛋白支架周围均明显存在抑菌环,证明2mg/ml组纳米银――胶原蛋白支架对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和大肠杆菌具有明显的抑制作用。1mg/ml组纳米银――胶原蛋白支架和不含纳米银的胶原蛋白支架没有显示出抑菌作用。根据以上研究结果,认为纳米银――胶原蛋白支架抑菌能力随支架中纳米银浓度的增加而提高,含2mg/ml纳米银的纳米银――胶原蛋白支架是最理想的外周神经再生支架。5.8只大鼠被随即分成两组,将实验组纳米银――胶原蛋白支架(含纳米银2mg/ml)与对照组胶原蛋白支架(不含纳米银)共24根每组12根分别称重后植入大鼠皮下,每只3根。每间隔一个月实验组与对照组各处死大鼠一只,并取出两组共6根支架材料通过扫描电镜观察支架在体内的降解情况。通过实验观察发现实验组与对照组降解过程极为相似。在植入大鼠皮下一个月后支架内部部分管壁降解,局部融合成粗大的管腔。两个月后更多的管壁发生降解。三个月后,内部降解的更为明显,失去内部结构支撑的支架材料部分发生塌陷。四个月后支架材料结构不再完整,仅余残存。将每观察日残存支架干燥称重,实验组四个月中残存支架分别为初期重量的79.2%、59.9%、38.3%和12.3%,对照组四个月中残存支架重量分别为初期的76.9%、51.4%、33.7%和10.1%。无论是实验组还是对照组的胶原蛋白支架都可以完全降解,实验组纳米银――胶原蛋白支架降解速度略慢于对照组。无论是实验组还是对照组胶原支架均可以满足神经再生临时支架的需要。6.使用纳米银――胶原蛋白支架(含纳米银2mg/ml)通过桥接手术植入大鼠坐骨神经两断端共2组每组6只共12只,每间隔一月处死两实验组大鼠各两只,取脑、脊髓、肝和肾通过原子吸收分光光度计测定吸光度并与标准银溶液对比,观察发现三个观察日所取大鼠组织器官均不含银成分,纳米银――胶原蛋白支架被证实随材料降解而释放的银颗粒不具有造成蓄积毒性的可能。实验的第二部分:使用对神经再生具有促进作用的层粘连蛋白和纤维连接蛋白通过静电吸附的作用与纳米银――胶原蛋白支架结合,使用吸附了细胞外基质蛋白的纳米银――胶原蛋白支架修复兔及大鼠坐骨神经10mm缺损,结果证实:1.纳米银在胶原蛋白支架内部分布均匀;2.层粘连蛋白在不含纳米银的胶原蛋白支架内部分布不均匀,大量成晶体状聚集,甚至局部堵塞微管腔,不利于外周神经的再生。在纳米银――胶原蛋白支架内部,层粘连蛋白均匀贴覆在微管壁上,没有晶体状聚集,可以更好的模拟神经再生时的微环境;3.使用层粘连蛋白复合过的纳米银――胶原蛋白支架修复兔坐骨神经10mm缺损,30d后通过电生理和透射电镜等检验方法证实坐骨神经通过神经支架的引导作用已经部分成功修复。修复效果与自体移植组相比较效果相近,明显优于不含纳米银的胶原蛋白支架组。通过实验证实吸附了层粘连蛋白的胶原蛋白支架内部微管结构可以部分的模拟雪旺细胞基底膜的组成从而对外周神经的再生具有明显的促进作用。4.纤维连接蛋白作为细胞外基质的主要成分之一同样在神经的再生过程中扮演着重要的角色。根据层粘连蛋白与纤维连接蛋白结构特点将这两种蛋白分层覆盖在纳米银――胶原蛋白支架内部微管壁上。使用这种支架修复大鼠坐骨神经10mm缺损30d可以部分恢复功能。与对照组自体神经移植相比较修复效果极为近似。层粘连蛋白和纤维连接蛋白共同黏附胶原蛋白支架可以进一步仿生神经再生过程中雪旺细胞的重要作用。本实验发现了纳米银颗粒在胶原蛋白支架中通过静电吸附作用可以将对神经再生具有重要作用的层粘连蛋白均匀吸附,这使得支架内部结构可以模拟有利于神经再生的微环境从而促进神经纤维的再生。基于这种想法制得的纳米银――胶原蛋白支架对于实验动物坐骨神经10mm缺损的修复效果均接近自体移植修复效果,为外周神经组织工程化修复提供了新的实验依据。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 一、组织工程周围神经支架材料的选择
• 二、组织工程周围神经种子细胞和蛋白的选择
• 三、组织工程周围神经构建方法的进展
• 第一部分 纳米银组织工程支架的制备与生物学特性研究
• 实验一 含不同浓度纳米银的外周神经支架的制备
• 实验二 纳米银外周神经支架机械强度测定
• 实验三 纳米银外周神经支架细胞毒性的实验
• 实验四 纳米银——胶原蛋白支架抗菌性的研究
• 实验五 纳米银――胶原蛋白支架体内降解的实验研究
• 实验六 纳米银――胶原蛋白支架体内蓄积毒性的实验
• 附图
• 第二部分 细胞外基质蛋白与纳米银组织工程支架复合对动物坐骨神经缺损修复的实验研究
• 实验一 层粘连蛋白与纳米银外周神经支架复合对兔坐骨神经缺损快速修复的实验研究
• 实验二 纤维连接蛋白与层粘连蛋白分层复合纳米银组织工程支架对大鼠坐骨神经缺损快速修复的实验研究
• 附图
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果