论文摘要
研究背景及目的：急性髓系白血病（AML）干／祖细胞的研究与造血干细胞（HSC）的研究密不可分。1961年人们提出HSC的概念，开创了干细胞生物学的研究领域，1994年Lapidot等首次通过特异细胞表面标志分离出了人AML的白血病干细胞（LSC），发现只有LSC才具有不断自我更新并维持其恶性显型的作用，证明了肿瘤干细胞（CSC）的客观存在。研究表明LSC的特异细胞表型为CD34+／CD38-或CD34+／HLA—DR-。除急性早幼粒细胞白血病（APL）以外，几乎所有的AML亚型均与LSC相关。干细胞（SC）具有自我更新及定向分化的特性。上世纪80年代中期我国学者成功使用药物将APL的原始细胞诱导为成熟细胞，开创了原始白血病细胞分化研究的先河。目前，LSC体外分析方法主要是白血病干／祖细胞集落（CFU—L）形成能力测定法。从SC到祖细胞（PC）及成熟细胞的增殖、分化、凋亡在很大程度上是多种细胞因子通过多种形式的相互作用调控的。本课题研究的目的为观察白血病细胞在特定的体外培养条件下，通过加入IL-3、IL-6、SCF、GM-CSF及G-CSF等细胞因子诱导髓系白血病干／祖细胞向成熟粒细胞分化。方法：本实验分为三部分。第一部分：包括两个预实验，均在相同的CFU—L培养条件下完成，该培养条件是由Agar、McCoy’5A培养基、胎牛血清（FBS）及滋养层细胞(经60CO辐射的正常人外周血白细胞)共同构成的混合体系，简称为Agar半固体培养基。实验分别为：1、AML患者骨髓（BM）单个核细胞（MNC）与正常人BM MNC集落生长对照实验：在上述CFU—L培养条件下，经IL-3、GM-CSF及SCF刺激的AML BM MNC与正常人BM MNC进行集落培养，分别在培养第0d、2d、5d及7d对集落计数，进行对照研究。2、新鲜AML BM MNC与液氮冻存AML BM MNC集落生长对照实验：在相同CFU-L培养条件下，经IL-3、IL-6、SCF、GM-CSF及G—CSF刺激的新鲜AML BM MNC与液氮冻存AML BM MNC进行集落培养，分别在培养第0d、2d、5d及7d对集落计数，进行对照研究；第二部分：髓系白血病干／祖细胞的集落培养实验：在IL-3、SCF、GM-CSF等细胞因子的刺激下，AML BM MNC在上述Agar半固体培养基上进行集落培养，并对其进行细胞形态学和细胞免疫分型的鉴定，以确定其是否为CFU—L。第三部分：髓系白血病干／祖细胞的体外分化实验：CFU-L的细胞分别接种于含与不含FBS的McCoy’s5A培养基中，加入IL-3、IL-6、SCF、GM-CSF及G-CSF等细胞因子进行培养，诱导其向成熟粒细胞分化，将培养至20d时收获的细胞进行细胞形态学和细胞免疫分型的鉴定，以确定其是否为成熟粒细胞。结果：第一部分：1、显微镜观察：正常人BM MNC在Agar半固体培养基上不形成集落，而AML BM MNC可以在培养第2天时开始出现，到第七天时集落数达到300-500个；统计学方法使用一个重复测量的两因素设计资料的方差分析，结果显示两组集落计数具有明显统计学差别。2．显微镜观察：新鲜AML BM MNC与液氮冻存AML BM MNC均在培养第2天开始出现集落，第7天集落数量最高；统计学方法与实验1相同，结果显示二者在相同培养条件下形成集落计数无明显统计学差别。第二部分：CFU—L为白血病干／祖细胞的集落，其细胞形态学类似小淋巴细胞，无特异表现，不应具有成熟血细胞或常见的白血病细胞的形态学特点，本实验收获的集落细胞的形态学符合上述特点；CFU—L的细胞免疫分型的特点为CD34+CD38-，其粒系分子表面标志CD13+CD15+CD33+的表达低，本实验收获的集落细胞CD34+CD38-的表达为16.94％±4.52％；CD13+、CD15+及CD33+的表达分别为5.26％±1.92％、6.72％±1.03％及6.77％±3.58％，符合CFU-L的特点。第三部分：体外分化实验最终获得的细胞，在含与不含FBS的培养基中培养第20天时收获细胞的平均计数分别为0.98×106个、90.67×106个，经成对t检验进行统计学分析，存在明显统计学差别；收获细胞没有特殊染色颗粒等成熟粒细胞的形态学特点，细胞免疫分型的鉴定结果：CD34+CD38-、CD13+、CD15+及CD33+表达分别为：0.30±0.17％、10.73±3.05％、9.67±2.59％及12.35±3.15％，均不符合成熟粒细胞的特点。结论：1、在CFU—L的培养条件下，正常人BM MNC不形成集落，可以排除HSC的污染；新鲜AML BM MNC与液氮冻存AML BM MNC形成集落的能力无明显差别，可以用液氮冻存的AML BM MNC样本做为实验样本的补充。2、经IL-3、SCF、GM-CSF等细胞因子刺激的AML BM MNC在本实验特制的Agar半固体培养基上能够形成髓系CFU-L。3、髓系CFU-L的细胞（即髓系白血病干／祖细胞）适合在FBS的McCoys5A的培养基中生长；髓系白血病干／祖细胞不能被IL-3、IL-6、SCF、GM-CSF及G-CSF等细胞因子诱导分化为成熟粒细胞。
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