论文摘要
以能量负平衡、脂肪动员、肝摄脂过多为主要病理学基础,以低血糖、高血酮为主要血液生化特点的奶牛酮病是奶牛重要的群发性常见多发病。肝脏作为酮体生成、糖异生和脂类代谢的主要器官,直接影响酮体、葡萄糖和甘油三酯生成,其代谢状态直接影响酮病的发生发展。因此,正确认识奶牛酮病肝脏代谢的特点和物质间代谢的关系,对揭示奶牛酮病发病机理具有重要的意义。本研究首次对酮病奶牛肝脏和健康奶牛肝脏进行了比较蛋白质组学研究。运用2D-E图谱全面展示酮病奶牛肝脏蛋白质差异表达;利用MALDI-TOF-TOF MS/MS对差异表达蛋白进行了鉴定;克隆表达了差异蛋白3-羟酰辅酶A脱氢酶（3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase type-2,HCDH）和乙酰辅酶A乙酰转移酶2（acetyl-Coenzyme A acetyltransferase 2,ACAT）,制备了抗血清,对其进行了Weston blot验证;基于3-羟酰辅酶A脱氢酶（3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase type-2,HCDH）、乙酰辅酶A乙酰转移酶2（acetyl-Coenzyme A acetyltransferase 2,ACAT）、延伸因子Tu（elongation factor Tu,EF-Tu）、α-烯醇化酶（alpha-enolase）和肌酸激酶（creatine kinase,CK）的差异表达情况,并参考国内外相关文献报道,构建了酮病奶牛肝脏代谢网络图谱;检测酮病奶牛肝脏脂肪酸氧化代谢途径关键酶的活性和主要中间代谢物的浓度,确证了酮病奶牛肝脏脂肪酸氧化代谢特征。比较蛋白质组学研究共鉴定酮病奶牛肝脏差异表达蛋白质38种,差异倍数均在1.4倍以上且满足统计学意义（P<0.05）,鉴定结果分值均在98分以上,鉴定结果准确。这些差异表达蛋白主要参与能量代谢、碳水化合物代谢、脂肪酸代谢、氨基酸代谢、抗氧化代谢、结构蛋白和核酸代谢。初步表明,酮病时肝细胞结构形态已遭到一定程度的破坏;肝细胞抗氧化能力降低;糖异生途径增强;脂肪酸氧化能力降低;蛋白质合成代谢降低。并对差异蛋白中的HCDH和ACAT进行了Weston blot验证检测,其结果与2D-E一致,表明2D-E实验结果准确可靠。比较蛋白质组学研究证实,酮病奶牛肝脏HCDH、ACAT、EF-Tu、alpha-enolase和CK表达差异倍数在1.5倍以上且满足统计学意义（P<0.05）。其中HCDH、ACAT和EF-Tu表达下降,alpha-enolase和CK表达上升。基于上述结果,并参考国内外相关文献报道,构建了酮病奶牛肝脏代谢网络图谱。在此基础上对酮病奶牛肝脏脂肪酸氧化代谢特征进行了确证,酮病奶牛血清BHBA和NEFA显著高于健康组奶牛;血糖、肝组织草酰乙酸（OAA）、肉毒碱棕榈酰基转移酶II（CPT II）、3-羟脂酰CoA脱氢酶（HAD）显著低于健康组奶牛;受试牛（酮病牛和健康牛）血清NEFA浓度与肝组织OAA, CPT II, HAD含量呈显著的负相关性;但血清BHBA与脂肪酸氧化代谢指标不相关性。有鉴于此,奶牛酮病肝脏代谢的特点是:脂肪酸氧化代谢减弱;酮体生成代谢和蛋白质合成代谢减弱;糖异生代谢增强。但是酮病奶牛仍然处于低糖血症和高酮血症状态,同时ATP可能过剩并以磷酸肌酸的形式储存于肝细胞内,乙酰辅酶A在肝细胞中聚集。高浓度的血清NEFA抑制了奶牛肝脏脂肪酸氧化代谢,这可能是影响奶牛酮病发生发展的主要代谢途径之一。